リガンドアッセイの差動放射状毛細管作用:細菌ヌクレオチドセカンドメッセンジャー結合細胞内タンパク質を同定するためのハイスループット技術

1. 全細胞ライセートの調製

1. 大腸菌K-12 ASKA ORFeomeコレクション株を、96ウェルディープウェルプレートに25μg/mLのクロラムフェニコールを含む1.5mLのLysogenyブロス(LB)に接種します。160 rpmで振とうしながら、30°Cで18時間一晩(O / N)成長させます。翌日、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)(最終0.5 mM)をO/N培養物に添加し、30°Cで6時間タンパク質発現を誘導します。
2. ペレットセルを500 x gで10分間、使用するまで-80°Cで凍結します。細胞を溶解するには、150 μL の溶解バッファー L1 (40 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl₂、2 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)、40 μg/mL DNase 1、および 0.5 mg/mL リゾチーム) を加えて、ペレットを再懸濁します。
3. 細胞を-80°Cで30分間凍結し、次に37°Cで20分間解凍します。このサイクルを3回繰り返して細胞を溶解します。ライセートは-80°Cで保存してから使用してください。

2. Rel_seqとGppAの精製

>注:Streptococcus equisimilisの組換えタンパク質Rel_seqと大腸菌K-12のGppAは、それぞれ放射性標識されたpppGppとppGppを合成するために使用されます。

1. 各タンパク質を過剰発現する細胞を増殖させ、採取します。
   1. 大腸菌BL21 DE3株をLBブロス中で指数関数的相(光学密度(OD)~0.3-0.4)まで増殖させ、1mLの培養液を6000×gで5分間スピンダウンし、上清をデカントし、100μLの氷冷TSBブロス(0.1 g/mL のPEG3350、0.05 mL/mLのジメチルスルホキシドを添加したLBブロス)で細胞を再懸濁します。 20 mM MgCl₂)。
   2. ヒスチジンタグ付きレルセックおよびgppAをそれぞれ100 ngのプラスミドと上記のTSB中の細胞懸濁液と混合し、氷上で30分間インキュベートします。細胞を42°Cで40秒間熱ショックします。混合物を氷上に2分間置き、室温で1 mLのLBブロスを加えて、細胞を37°Cで1時間回復させ、160 rpmで撹拌します。
   3. 回収した細胞をLB寒天プレートにプレートし、対応する抗生物質(Rel_seq:100 μg/mL ampicillin;GppA:30μg/mLカナマイシン)です。翌日、コロニーをLBブロスに接種して、37°Cで両菌株のO/N前培養を開始します。
   4. 18時間後、500 mLのLB培地に10 mLのO / N培養物と対応する抗生物質を接種します。160rpm、37°Cで振とうして培養します。OD_600nmが0.5-0.7に達したら、0.5 mM IPTGを添加し、160 rpmで振とうしながら30°Cで3時間増殖することにより、タンパク質発現を誘導します。
   5. 6084 x gで4°Cで10分間回転して細胞を回収し、ペレットを氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の20 mLに再懸濁し、1912 x gで4°Cで20分間再遠心分離します。 上清をデカントし、使用前にペレットを-20°Cで凍結します。
2. ニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)親和性精製
   手記：この時点から、サンプルが冷えていることを確認してください。
   1. 40 mLの氷冷溶解バッファーL2(50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5%グリセロール、10 mMイミダゾール、10 mM β-メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤(EDTAフリー錠剤、材料表を参照)を添加して、ペレットを再懸濁します。超音波処理(60%振幅、2秒オン/4秒オフ8分間オン)で細胞を溶解します。23,426 x gで40分間4°Cで遠心してライセートを清澄化し、上清を精製します。
   2. 上記の遠心分離中に、Ni-NTA樹脂を調製します。
      1. 均質化したNi-NTA樹脂500μLをスタンディングポリプロピレンクロマトグラフィーカラムに移し、15分間沈殿させて保存溶液を排出します。レジンを15 mLの超純水で2回洗浄した後、カラムを15 mLの溶解バッファーL2で洗浄します。
   3. ステップ1で透明化した細胞ライセートの上清をカラムにロードし、流します。カラムを 30 mL の洗浄バッファー(50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5% グリセロール、20 mM イミダゾール)で洗浄します。
   4. 400 μLの溶出バッファー(50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5%グリセロール、500 mMイミダゾール)でタンパク質を3回溶出します。その後、さらに300 μLの溶出バッファーで溶出を繰り返します。溶出したタンパク質を最終容量700 μLまで組み合わせます。
3. ゲルろ過
   1. ゲルろ過バッファー(50 mM Tris、pH 7.5、200 mM NaCl、5%グリセロール)を調製します。サイズ排除カラムを1カラム容量(25 mL)のゲルろ過バッファーで洗浄します。
   2. 500 μLループを使用して上記の700 μLサンプルをロードし、0.5 mL/minで分析し、それぞれのタンパク質を含む0.5 mLの容量の2〜3つのフラクションを収集します。
   3. スピンカラムを使用して各タンパク質を含む画分を結合して濃縮し、Bradfordアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。

3. P標識pppGppとppGppの³²個の合成

1. スクリューキャップチューブで小規模なRel_seq反応を組み立てます(表1を参照).
   手記：放射性試薬の取り扱いは、認可された場所および個人用保護具でのみ行ってください。
2. チューブをサーモミキサーで37°Cで1時間インキュベートし、次に95°Cで5分間インキュベートし、氷上に5分間置く。沈殿したタンパク質を15,700 x gで5分間スピンダウンし、上清(^{合成された32}P-pppGpp)を新しいスクリューキャップチューブに移します。
3. ³²P-ppppGppから³²P-ppGppを合成するには、³²P-ppppGpp生成物の半分を新しいスクリューキャップチューブに移し、1 μM GppAを追加します。チューブを37°Cで10分間、95°Cで5分間インキュベートした後、氷上に5分間置く。
4. 沈殿したタンパク質を15,700 x gで5分間スピンダウンし、上清(合成^された32P-ppGpp)を新しいスクリューキャップチューブに移します。
5. 1.5 M KH₂PO₄、pH 3.4 を移動相として、1 μL のサンプルを薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート(ポリエチレンイミン修飾セルロース TLC プレート)に 1 μL を流し、³²P-ppppGpp および ³²P-ppGpp を分析します。
   手記：コントロールとして^α-32P標識グアノシン5'-三リン酸(³²P-α-GTP)を使用します。
6. TLCプレートを完全に乾燥させ、透明なプラスチックフォルダーの間に置き、5分間保存蛍光体スクリーンにさらします。フォスフォイメージャーを使用して信号を視覚化および定量化します
   手記：³²P-ppppGppと³²P-ppGppの比率が85%を超える場合、表1を用いて大規模な反応(500 μL、96ウェルプレート20枚のスクリーニングに十分)をアセンブルし、合成することができます。

4. (p)ppGppの標的タンパク質のDRaCALAスクリーニング

1. 20 μLの全細胞ライセートを解凍し、96ウェルV底マイクロタイタープレートに移します。Serratia marcescens由来のエンドヌクレアーゼ2.5 U/wellを添加し、37°Cで15分間インキュベートしてライセートの粘度を低下させます。ライセートを氷の上に20分間置きます。
2. ³²P-pppGppと³²P-ppGppを1:1の比率で混合し、1x溶解バッファーL1を添加して、(p)ppGppの最終濃度を4 nM.
   にします 手記：pppGppとppGppの化学的類似性を考えると、両方の化学物質を混合するとスクリーニングプロセスが簡素化されます。
3. マルチチャンネルピペットとフィルター付きピペットチップを使用して、10 μLの(p)ppGpp混合物を細胞溶解物に添加して混合します。室温(RT)で5分間インキュベートします。
4. 96 x ピン ツールを 0.01% 非イオン性洗剤溶液に 30 秒間入れて洗浄し、ティッシュペーパーで 30 秒間乾燥させます。
5. ピンツールを上記の96ウェルサンプルプレートに置き、30秒待ちます。ピンツールをまっすぐ上に持ち上げ、ニトロセルロースメンブレンに30秒
   手記：スポットが欠落している場合は、ピペットとフィルター付きチップで対応するサンプルの2μLをスポットします。以下に示すように、同じサンプルの重複スポットを作成することをお勧めします。
6. 膜をRTで5分間乾燥させ、透明なプラスチックフォルダーの間に膜を置き、それを貯蔵蛍光体スクリーンに5分間さらします。

5. 標的タンパク質の定量と同定

1. phosphorimagerに関連付けられている分析ソフトウェアを使用して、視覚化されたプレートの.gelファイルを開きます。配列解析機能を使用して、12 列 x 8 行のグリッドを設定することにより、96 個のスポットを定義します。
2. スポット全体の外縁を囲むように大きな円を定義します (図 1 を参照)。定義された大きな円の Volumn+Background と Area をエクスポートし、スプレッドシートに保存します.
   手記：必要に応じて、個々の円をスポットと完全に重なるように再配置し、個々の円のサイズを変更して実際のスポットよりわずかに大きくします。
3. 定義された円のサイズを小さくして、小さな内側のドットを囲みます。Volumn + Background、および定義された小さな円の領域をエクスポートし、スプレッドシートに保存します。
4. 図 1 の式を使用してスプレッドシートの結合分数を計算し、データをプロットします。他の大多数のウェルと比較して高い結合画分を示すウェル内の潜在的な結合タンパク質を特定します。

表1:³²個のP標識pppGppの小規模および大規模合成反応のアセンブル情報 *10x Relseq緩衝液には、250 mM Tris-HCl、pH 8.6、1M NaCl、80 mM MgCl₂が含まれています。略語:pppGpp =グアノシン五リン酸。

図1:結合画分の定量化と計算。詳細については、テキストを参照してください。簡単に言うと、DRaCALAスポットは、スポット全体と内側の暗いドット(つまり、テストされたタンパク質の結合により保持された(p)ppGpp)を囲む2つの円を描くことによって分析されます。比結合信号とは、非特異的背景信号(A1×((S2-S1)/(A2-A1))で計算)を差し引いた内側円(S1)の放射性信号です。結合画分は、特定の結合信号を全放射性信号(S2)で割ったものです。略語:DRaCALA = リガンドアッセイの差動放射状毛細管作用;(p)ppGpp = グアノシン五リン酸および四リン酸RT =室温。