蛍光プローブイメージングアッセイ:活性酸素種誘導剤処理した培養腸管オルガノイド細胞の酸化ストレスを可視化する技術

要約

出典:Stedman, A. et al., Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe. J. Vis. Exp. (2021).

この動画では、培養オルガノイドの酸化ストレスを可視化する技術について説明しています。この研究は、さまざまなROSモジュレーターで処理した後、オルガノイドに存在するさまざまな細胞タイプにおけるROS蓄積による酸化ストレスのレベルを理解するのに役立ちます。

プロトコル

1. 共焦点顕微鏡による3次元オルガノイドの酸化ストレスの可視化

1. μ-Slide 8ウェルチャンバーに播種したオルガノイドを、対応するウェルに1 μLのN-アセチルシステインまたはNACストック溶液を加えて、最終濃度1 mMを得ます。
2. 37°Cおよび5%CO₂で1時間インキュベートします。
3. 対応するウェルに1 μL tBHPストック溶液を加えて、最終濃度200 μMを得ます。
4. 37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベートします。
5. 蛍光プローブの1.25 mM希釈液のウェルあたり1 μLを添加して、最終濃度5 μMを得ます。
6. 1.25 mg/mL希釈液のHoechstを1ウェルあたり1 μL添加し、最終濃度5 μg/mLを得ます。
7. 37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベートします。
8. BMMを邪魔せずにメディアを取り外してください。フェノールレッドを含まない温かいDMEMを250μLをやさしく加えます><。 手記：長期取得が予定されている場合は、フェノールレッドを含まない成長因子化合物をDMEMに添加してください。
9. 蛍光プローブ(ROS)を検出するサーマルチャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を使用してオルガノイドをイメージングします
   手記：蛍光プローブの励起/発光(ex/em)は644/665、Hoechst(核)のex/emは361/486、GFP(Lgr5-GFPマウス由来の腸管幹細胞)のex/emは488/510です。63倍油浸対物レンズは、幹細胞のシグナルを検出するために使用されます。サンプル間でレーザー設定を変更しないでください。20倍の対物レンズを使用して、ROS生成の概要を把握できます。
10. ポジティブコントロールを使用して、ROS信号のレーザー強度と時間露光を設定し、ネガティブコントロールでこの信号が低いことを確認します。
11. 接眼レンズを使用してスライドをスクリーニングし、発現しているGFPオルガノイドを特定し、レーザー強度を調整します
    手記：この手順は手動で実行します。
12. オルガノイド全体のステッチ画像を取得するための位置を定義します。25 μm の z スタック (ステップ サイズ 5 μm) を設定して、オルガノイドの 1 つの細胞層を示すセクションを取得します。
    手記：顕微鏡のユーザーマニュアルを参照して、セットアップを最適化してください。生細胞を使用して、インキュベーション終了後1時間以内に取得を行う必要があります。
13. オープンソースの画像処理ソフトウェアで画像を開きます(資料の表を参照)。
14. zスタックを通過し、オルガノイドの中央が適切に表現されているセクションを選択し、選択した領域で新しい画像を作成します。
15. 次の手順で画像を定量化します。
    1. フリーハンドの線ツールを選択します。
    2. 原子核に沿って線を引きます.
       手記：幹細胞のみを解析する場合は、GFP陽性細胞を示す領域のみを選択します。
    3. 線幅を広げて、細胞層を線で覆い、管腔の破片を含めないようにします。
    4. ROSシグナルのチャンネルを選択し、選択した領域の蛍光強度を測定し、値に注釈を付けます。
    5. 信号がない場所に線を引き、背景の蛍光強度を測定し、その強度を前の値から差し引いて最終的な強度を求めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス
LGR5-EGFP-IRES-creERT2 (LGR5- GFP)	ジャクソン研究所
成長培地
アドバンスドDMEM F12(DMEM/F12)	サーモフィッシャー	12634010
ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)	サーモフィッシャー	15140122	原液濃度:100倍(10,000単位/mLのペニシリンと10,000μg/mLのストレプトマイシン)
FLuoroBrite DMEM(DMEM無フェノールレッド)	サーモフィッシャー	A1896701
ヘキスト33342	サーモフィッシャー	H3570-J	10 mg/mLで保存
マトリゲル成長因子低減、フェノールレッドフリー(基底膜マトリックス)	コーニング	356231	解凍した状態で冷蔵庫に保管した後、氷上で1時間保存し、500mLのアリコートを調製して-20°Cで保存
μ-Slide 8ウェルチャンバー	イビディ	80826
N-アセチルシステイン(NAC)	シグマ	A9165の
tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBCHP)溶液(70%wt.H2O2)	シグマ	458139
プログラムと機器
フィジー/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ ダウンロード画像生成
オブザーバー.Z1	ツァイス		共焦点システム
Opterra (スイープフィールド コンフォカル)	ブルカー		共焦点システム
高速EMCCDカメラEvolve Delta 512	フォトメトリクス		共焦点システム
プリズム	GraphPadソフトウェア		統計分析