酸化ストレスを定量化するためのフローサイトメトリーアッセイ:蛍光プローブを使用して腸管オルガノイドの活性酸素種を定量するアッセイ

要約

出典:Stedman, A., et al., 活性酸素種感受性蛍光プローブを用いたマウス腸オルガノイドの酸化ストレスの分析.J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、GFP発現トランスジェニックマウスから得られた3D腸オルガノイドのROSレベルを定量化するフローサイトメトリーアッセイを示しています。この方法は、ROS産生に対する試験化合物の有効性を調査するためのin vitro実験モデルを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腸管オルガノイド培養用試薬・材料の準備

1. 増殖培地を調製するには、1x グルタミン、1x ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)溶液、10 mM の HEPES、50 ng/mL のマウス EGF、20 μg/mL のマウス Noggin、500 ng/mL のマウス R-Spondin1 を添加した高度な DMEM/F-12 を混合します(材料の表を参照)。陰窩の抽出中は、培地を室温(RT)に置いておきます。
   手記：未使用の培地をアリコートで-20°Cで凍結し、凍結して解凍することは避けてください。
2. 50 mLのチューブに40 mLのAdvanced DMEM/F-12を充填し、氷上に保ちます
   手記：未使用の培地は4°Cに保管してください。オルガノイドの継代に使用されます。
3. 細胞培養プレート(96ウェル丸底)をインキュベーター内で37°Cに予温します。
4. 氷上で基底膜マトリックス(BMM)(材料の表を参照)アリコートを解凍します(プロトコルを開始する前、またはクリプトをめっきする少なくとも1時間前).
   手記：BMMは冷たく保たないとすぐに固まります。
5. 1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液をDPBS(DPBS-P / S)に追加して、洗浄/フラッシング溶液を準備します。.
6. 100 mmのペトリ皿に10 mLの冷たいDPBS-P / Sを充填し、6本の15 mLチューブに10 mLのDPBSを充填し、F1からF6にラベルを付けます。
7. 0.5 M EDTAをDPBSで希釈して、30 mLの10 mM EDTA溶液を調製します。2本の15 mLチューブに10 mLの10 mM EDTAを充填し、E1およびE2を標識します。
8. すべての溶液を4°Cに予冷し、処置中は氷の上に置いてください。

2. 腸オルガノイド培養

1. 国の規則および規制に従って、8〜10週齢のLgr5-EGFP-IRES-creERT2(Lgr5-GFP)マウスを犠牲にします。
2. 十二指腸(胃から5 cm)と回腸(盲腸から10 cm)の間の領域を包含する空腸を5〜8 cm採取し、氷の上で冷たいDPBS-P / Sに保ちます。
3. 5〜10mLの冷たいDPBS-P / S.
   で洗い流して、腸の内容物を洗浄します 手記：自家製のフラッシングシリンジは、200 μL のチップを 10 mL シリンジノズルに差し込むことで入手できます。
4. ボールチップハサミ(材料の表を参照)を使用して腸を縦方向に開きます(組織の損傷を防ぐため)。
5. 鉗子を使用して、室温で冷たいDPBS-P / Sを入れたシャーレに組織を移し、振とうしてすすぎます。
6. プラスチック製のパスツールピペットで腸を吸引し、10 mLの冷たい10 mM EDTAが入ったE1とラベル付けされた15 mLチューブに移します。
7. チューブを3回反転させ、氷上で10分間インキュベートします。
8. プラスチック製のパスツールピペットを使用して、10 mL DPBSを含むチューブF1に組織を移します。2分間渦巻きます(通常の渦巻きでは、チューブを手で持ち、腸がきれいに渦を巻くことを確認します)。
9. 10 μLの画分をシャーレに入れ、顕微鏡下で画分の品質を評価します。
   手記：すべてのボルテックスステップは最高速度で実行され、各フラクションの品質は顕微鏡で評価する必要があります(図1)。
10. プラスチック製のパスツールピペットで腸を吸引し、10mLのDPBSとボルテックスが入ったチューブF2に2分間移します。
11. ステップ2.10を繰り返し、10 mL DPBSを含むチューブF3に組織を移し、ボルテックスを2分間移します。
12. ステップ2.6と同様にEDTAインキュベーションを繰り返し、10 mM EDTAを含むチューブE2に組織を移します。
13. チューブを3回反転させ、氷上で5分間インキュベートします。
14. ステップ2.10を繰り返し、10 mL DPBSを含むチューブF4に組織を移し、ボルテックスを3分間移します。
15. ステップ2.14を繰り返し、10mLのDPBSを含むチューブF5に組織を移し、ボルテックスを3分間移します。
16. ステップ2.15を繰り返し、10 mL DPBSを含むチューブF6に組織を移し、ボルテックスを3分間移します。
17. 重力によるろ過を70 μmのセルストレーナーで50 mLのチューブ(氷上)に組み合わせ、絨毛や大きな破片を除去します
    手記：通常、F5とF6は、多数の陰窩を含み、破片が少ないフラクションです。
18. 陰窩を150 x g、4°Cで3分間回転させます。
19. チューブを空にし、ペレットを機械的に破壊し、5 mLの冷たいDMEM / F12を追加します。
20. 懸濁液10μLをシャーレに入れ、顕微鏡下で手動でアリコートに存在する陰窩の数を数えます
    手記：単一のセルや小さな破片を数えないでください。
21. ウェルごとに300個のクリプトがメッキされ、Wがウェルの数、Nが懸濁液の10μLからカウントされたクリプトの数であることを考慮して、必要なクリプトの懸濁液の量(V)をμLで計算します。陰窩を新しい15mLチューブに移します.
    手記：計画された実験で少量を使用する場合は、1.5 mLの遠心チューブを使用できます。
22. 陰窩を200 x g、4°Cで3分間回転させます。
23. ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。
24. ペレットを機械的に破壊し、成長培地を穏やかに添加して、90陰窩/μLの濃度を得ます。
25. 2容量の原液BMMを加えて、最終濃度を30陰糠/μLにします。混合物に気泡を入れずに慎重にピペットで上下させます。
    手記：BMMの固化を避けるために、常にチューブを氷の上に置いてください。
26. 10 μLの陰窩/ BMMミックスを各ウェルにプレートします。フローサイトメトリー解析には、丸底の96ウェルプレートを使用してください。各ウェルの中央に10μLをドーム状に分配します
    手記：オルガノイドをイメージングアッセイ用の薄層としてプレート化し、詳細なイメージングを可能にします。
27. プレートをRTで5分間放置して、BMMが固まるようにします。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂で15分間置きます。
28. BMMが剥がれないように注意しながら、各ウェルに250μLの増殖培地を加えます。
29. プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂で置く。
30. 培養の4日目から6日目の間にROS分析を実行します。それ以外の場合は、培地を交換し、いくつかの長い出芽構造が現れた後、および死んだ細胞がオルガノイドの内腔に蓄積したときにオルガノイドを分割します。

3. オルガノイドの継代

1. 培養6^日目から小腸オルガノイドの継代を開始し、重要な出芽構造が形成され、オルガノイドの内腔が暗くなったとき
   手記：オルガノイドの内腔は、死んだ細胞、破片、粘液の蓄積により暗くなります。オルガノイドが分裂する前に成長しすぎないようにしてください。分裂率はオルガノイドの成長に依存します。オルガノイドを6日目に1:2、10日目に1:3の比率で継代することが推奨されます。
2. 15 mLのチューブに4 mLの冷たいAdvanced DMEM / F-12を満たし、氷上に保ちます.
   手記：ここでは、96ウェル培養プレートの容量を提供します。別の形式を使用する場合は、それに応じて音量を調整してください。
3. BMMドームに触れずに、ウェルからピペットまたは真空ポンプで培地を慎重に吸引し、廃棄します。
4. ウェルあたり100 μLの冷たいAdvanced DMEM/F-12を加えます。ピペットを上下に動かしてBMMを破砕し、ウェルの内容物を15mLチューブに移します。
5. ウェルを200μLの冷たいAdvanced DMEM/F-12で洗浄し、同じチューブに集めます
   手記：同じ実験条件から複数のウェルを継代する場合、ウェルの内容物を同じ15 mL収集チューブにプールできます。
6. 15 mLの収集チューブを100 x gで4°Cで5分間回転させます。
7. 上清を捨て、ペレットに1mLの冷たいAdvanced DMEM/F-12を加えます。P1000チップを使用して、P10チップ(フィルターなし)を手に取り、少なくとも20回上下にピペットします。
8. 4 mLの冷たくしたAdvanced DMEM/F-12をチューブに加えます。300 x gで4°Cで5分間遠心します。
9. ペレットを乱さずにピペットまたは真空ポンプで上清を吸引します。次に、ペレットを機械的に破壊します。
10. 増殖培地で希釈したBMM(2:1の比率)を添加します。混合物に気泡を入れずに慎重にピペットで上下させます。
11. 10 μLの陰窩/ BMMミックスを各ウェルにプレートします。
12. プレートをRTで5分間保持して、BMMが固まるようにします。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂で15分間置きます。
13. 250 μL の増殖培地を各ウェルに加えます.
    手記：BMMを取り外しないように注意してください。
14. プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂で置く。

4. 腸管オルガノイドの酸化ストレスを評価するための試薬と材料の調製

1. 阻害剤N-アセチルシステイン(NAC)の250 mMストック溶液を調製し(材料表を参照)、10 mgを245 μLのDPBSに再懸濁します。1 mMの最終濃度で使用してください。
2. 誘導剤Tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)の50 mMストック溶液(70%)を水で調製し、496.8 μLのDPBSで3.22 μLを希釈します。最終濃度200μMで使用してください。
3. フローサイトメトリー試験では、蛍光プローブの250 μMのワーキング溶液(材料表を参照)を調製し、ストック溶液をDMSOで1/10に希釈します。最終濃度 1 μM で使用.
   手記：製造元の指示に示されているように、蛍光プローブは光と酸素に敏感です。在庫とアリコートは、何度も開閉しないでください。
4. フローサイトメトリーアッセイでの死細胞の識別に使用する0.1 μg/mL DAPIの最終溶液をDPBSで調製します
   手記：これらのステップでは、図2Aに示す条件を使用して、アッセイに含める必要のあるネガティブコントロールとポジティブコントロールの使用について説明します。このアッセイは、抗酸化化合物または酸化促進化合物の試験に使用できます。手順は同じで、唯一の違いは、蛍光色素を使用する前に化合物を添加する場合です。

5. フローサイトメーターを用いた解離オルガノイドの酸化ストレスの定量化

1. ネガティブコントロール用のウェルに1 μL NACストック溶液を添加して、最終濃度1 mM.
   を得ます 手記：96ウェル丸底プレートにメッキされたオルガノイドを使用してください。
2. 37°Cおよび5%CO₂で1時間インキュベートします。
3. 対応するウェルに1 μL tBHPストック溶液を加えて、最終濃度200 μMを得ます。
4. 37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベートします。
5. マルチチャンネルピペットで、付属のBMMを邪魔せずに培地を取り出し、別の96ウェル丸底プレートに移します。このプレートは脇に置いておきます。
6. 100 μLのトリプシンを加え、マルチチャンネルピペットで少なくとも5回ピペットを上下させてBMMを破壊します。
7. 37°Cおよび5%CO₂で5分以内にインキュベートします。
8. マルチチャンネルピペットでは、オルガノイドを解離するために少なくとも5回ピペットを上下させます。
9. 室温で300 x gで5分間遠心します。
10. プレートを反転させて上清を捨てます。ステップ6.3で収集した培地を対応するウェルに戻し、ピペッティングを5回上下させて細胞を再懸濁します。
11. 最終濃度1 μMで蛍光プローブを添加し、250 μM希釈液からウェルあたり1 μLを添加し、37 °Cおよび5% CO₂.
    で30分間インキュベートします 手記：装置の設定に必要なウェルに蛍光プローブを追加しないでください(図2B)。
12. 室温で300 x gで5分間遠心します。
13. 250 μL の 0.1 μg/mL DAPI 溶液で細胞を再懸濁します。サンプルを適切なフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に置いて分析を進めます.
    手記：装置の設定に必要なウェルにDAPIの代わりにPBSを追加します(図2B)。
14. モノスタンスサンプルを使用して、各蛍光色素の未染色制御およびレーザー電圧の順方向および側方散乱電圧設定を最適化します。
15. 適切なゲーティング戦略 (図 3A) を使用して、少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。
    注: 50,000 イベントが推奨されます。詳細な取得設定は、使用する機器によって異なります。

結果

図1:陰窩とオルガノイドの代表的な画像。(A)EDTAとの最初のインキュベーション後に得られた画分F1の例で、絨毛(正方形)が豊富で、いくつかの破片(星)と陰窩(円)があります。(B)陰窩に富んだ分数F4の例。(C)70μmのセルストレーナー(スケールバー、200μm)でろ過した後に得られた単離された陰窩のみを示す懸濁液。(D、E、および F)。典型的なオルガノイドは、陰窩をBMM(スケールバー、100μm)に埋め込んだ後、それぞれ1日後、3日後、5日後に得られた。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス
LGR5-EGFP-IRES-creERT2 (LGR5-GFP)	ジャクソン研究所
成長培地
アドバンスドDMEM F12(DMEM/F12)	サーモフィッシャー	12634010
B-27サプリメント、ビタミンAを除いたもの	サーモフィッシャー	12587010	ストック濃度:50倍
GlutaMAX(グルタミン)	サーモフィッシャー	35050038	ストック濃度:100倍
ヘペス	サーモフィッシャー	15630056	ストック濃度:1 M
マウスEGF	研究開発	2028-EG-200	ストック濃度:500 μg/mL(PBS中
マウスノギン	研究開発	1967-NG/CF	ストック濃度:100 μg/mL(PBS)
マウス R-spondin1	研究開発	3474-RS-050	原液濃度:50 μg/mL(PBS中
N-2サプリメント	サーモフィッシャー	17502048	ストック濃度:100倍
ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)	サーモフィッシャー	15140122	原液濃度:100倍(10,000単位/mLのペニシリンと10,000μg/mLのストレプトマイシン)
材料
70 μmセルストレーナー	コーニング	352350
96ウェル丸底	コーニング	3799
ボールチップハサミ	ファインサイエンスツールGMBH	14086から09
CellROX® ディープレッド試薬	サーモフィッシャー	C10422
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩素水和物)(蛍光プローブ)	サーモフィッシャー	D1306	10 mg/mLで保存
DPBS 1x カルシウムなしマグネシウム (DPBS)	サーモフィッシャー	14190144
マトリゲル成長因子低減、フェノールレッドフリー(基底膜マトリックス)	コーニング	356231	解凍した状態で冷蔵庫に保管した後、氷上で1時間保存し、500mLのアリコートを調製して-20°Cで保存
N-アセチルシステイン(NAC)	シグマ	A9165の
tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBCHP)溶液(70%wt.H2O2)	シグマ	458139
TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッド (トリプシン)	サーモフィッシャー	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA、pH8.0	サーモフィッシャー	15575020
Y-27632	シグマ	0503年度	組織解離時の細胞死を最小限に抑えるために使用される岩石阻害剤
プログラムと機器
Attune NxT(フローサイトメーター)	サーモフィッシャー		フローサイトメーターアナライザー
フロージョ	BDバイオサイエンス		FACS分析
プリズム	GraphPadソフトウェア		統計分析

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