SUMO化アッセイ:イムノブロッティングにより基質タンパク質のSUM化状態を検出するIn vitro技術

要約

出典:Yang, W. S. et al., In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、シーケンシャル酵素カスケードを用いた基質タンパク質のSUMO化のin vitro法を実演しています。さらに、タンパク質のSUMO化状態は、電気泳動および免疫ブロッティング技術を用いて同定されます。

プロトコル

1. バキュロウイルス発現コンストラクトの調製

1. K-bZIPのcDNAをN末端エピトープタグを持つ二重発現バキュロウイルスベクター(材料表を参照)にクローニングすることにより、SUMO E3リガーゼK-bZIPを精製します。オクタペプチドタグ(プロトコール全体でvector-tag-K-bZIPとして示されています)を使用して成功を収めました
   手記：K-bZIPポリメラーゼ連鎖反応(PCR)クローニング用のDNAテンプレートは、ドキシサイクリン処理後にTREx F3H3-K-Rta BCBL-1細胞から単離されたRNAからcDNAを逆転写したものです。
   1. 完全長K-bZIP cDNAをCpoIクローニング部位を持つ二重発現ベクターに転写します。CPOのPCR産物と1 μgのデュアル発現ベクターを37°Cで3時間消化します。
   2. 0.8%アガロースゲル上で電気泳動した後、消化したDNAを分離して抽出します。インサート(K-bZIP)とベクターをT4 DNAリガーゼでライゲーションし、製造元の指示に従って16°Cで30分間ライゲーションします(材料表を参照)。
   3. 1.5 mLチューブ内の50 μLのコンピテント大腸菌細胞「A」(材料表を参照)に5 μLのライゲーションDNAを添加します。氷の上に30分間置きます。次に、1.5 mLチューブを42°Cのウォーターバスで45秒間インキュベートし、すぐにチューブを氷上に3分間置きます。
   4. 600 μL S.O.C.培地(0.5%(w/v)酵母抽出物、2%(w/v)トリプトン、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、20 mM MgSO₄、および4%(w/v)グルコース)をチューブに加え、37°Cで1時間インキュベートします。次に、チューブを室温で600 x gで3分間遠心分離します。
   5. 上清を取り除き、ペレットを60 μLのLuria-Bertani培地(LB;1%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)酵母抽出物、および85 mM NaCl)で再懸濁し、100 μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレートに広げます。寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートします。
   6. 100 μg/mL アンピシリンを含む 5 mL LB 培地に接種するコロニーを 1 つ選択し、37 °C で 16 時間、250 rpm 振とうして培養します。次に、プラスミド(vector-tag-K-bZIP)を、製造元の指示に従ってプラスミド抽出キットで抽出します(材料表を参照)。
2. ベクタータグ-K-bZIPをコンピテント大腸菌細胞B(材料表参照)に変換することにより、タグ-K-bZIPを保有する組換えバクミドを生成します。
   1. 0.2 μg のベクタータグ K-bZIP プラスミドと 100 μL のコンピテント E を混合します。 大腸菌細胞「B」を1.5mLチューブに入れ、氷上に30分間置きます。チューブを42°Cのウォーターバスで45秒間インキュベートし、すぐにチューブを氷上に3分間置きます。
   2. 900 μLのS.O.C.培地をチューブに加え、50 rpmで回転させながら37°Cで4時間インキュベートします。次に、10 μL の培地を取り、さらに 50 μL の S.O.C 培地を加えて、50 μg/mL カナマイシン、7 μg/mL ゲンタマイシン、10 μg/mL テトラサイクリン、100 μg/mL ガラクトシダーゼ基質、および 40 μg/mL イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) を含む LB 寒天プレートに広げます。 プレートを37°Cで48時間インキュベー
   トします。
   3. 50 μg/mL カナマイシン、7 μg/mL ゲンタマイシン、および 10 μg/mL テトラサイクリンを含む 5 mL LB 培地に 1 つの白色コロニーを接種します。37°Cで250rpmを16時間振とうしながらインキュベートします。
   4. タグ-K-bZIPを有する組換えバクミドDNAを単離し、定量し、1 μg/μLの濃度で再懸濁します。
3. タグ-K-bZIPを含む組換えバクミドDNA1 μgを6ウェルプレートの1ウェルでSf9細胞にトランスフェクションすることにより、タグ-K-bZIPを発現する組換えバキュロウイルスを作製します。
   1. 6ウェルプレートの各ウェルに10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ゲンタマイシンを添加した2 mLのGrace's Insect Mediumに2 x 10⁶ Sf9細胞(材料表を参照)を播種し、27°Cで1時間インキュベートします。
   2. 10% FBS、1% ゲンタマイシン、および 1% 界面活性剤 C (材料表を参照) を 27 °C で供給した Grace's Insect Medium で Sf9 細胞の対数期培養を、140 rpm の軌道懸濁液中で維持します。血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して細胞をカウントします。細胞生存率は95%を超える必要があります。2〜3日ごとに1:3の継代培養比(最小密度~0.5 x 10⁶細胞/mL)を使用して細胞を維持します。
   3. 2 mLチューブに2 μLのバクミドDNA(1 μg/μL)と98 μLの還元血清培地(材料表を参照)を加えます。次に、4 μLのトランスフェクション試薬(材料表を参照)をチューブに加え、よく混合します。室温で15分間インキュベートします。
   4. このトランスフェクション混合物(104 μL)を各ウェルに加え、27°Cで12〜16時間インキュベー
   トします。
   5. やさしい吸引で使い果たされた培地を取り除き、10%FBSと1%ゲンタマイシンを供給した2mLの新鮮なGrace's Insect Mediumと交換します。.Sf9細胞はプレート表面にゆるく付着し、穏やかな吸引で邪魔されることはありません。
4. トランスフェクション後に組換えバキュロウイルスを採取し、バキュロウイルスを増幅して、さらなる実験のための高力価ストック(P1)を取得します。
   1. 培地交換の72時間後、滅菌セルリフターを使用してSf9細胞を掻き取り、各個々のウェルから上清を1.5mLチューブに収集し、10秒間ボルテックスします。
   2. 4°Cで150 x gで3分間遠心分離します。上清をP0バキュロウイルスとして収集し、1.5 mLチューブ(各チューブに1 mLバキュロウイルス)にアリコートします。.-80°Cで保存してください。
   3. 10 cmシャーレに10% FBSおよび1%ゲンタマイシンを添加した10 mL Grace's Insect Mediumに1 x 10 7 Sf9細胞を播種し、27°Cで1時間インキュベー
   トします。
   4. tag-K-bZIPを発現する組換えバキュロウイルスを増幅するには、播種したSf9細胞に0.5 mLのP0バキュロウイルスを添加し、27°Cで48時間インキュベー
   トします。
   5. 上清をP1バキュロウイルスとして15mLチューブに集め、4°Cで最大1ヶ月間保存します。

2. K-bZIPの精製

1. ステップ1.3.2で説明したように、10%FBS、1%ゲンタマイシン、および1%界面活性剤Cを添加したGrace's Insect Mediumで、27°C、140rpmの眼窩懸濁液中でSf9細胞の対数期培養を維持します。
2. 形質導入の日に、バキュロウイルス含有上清(P1)1 mLを2 mLのSf9細胞に2 x 10⁶細胞/mLの密度で加えます。
3. Sf9細胞をオービタルシェーカーで27°C、72時間インキュベートし、140 rpmで振盪した後、2,740 x gで4°Cで15分間遠心分離して回収します。
4. 10 mL溶解バッファー(20 mM HEPES pH 7.9、0.5 M NaCl、1%界面活性剤A(材料表を参照)、2%グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル)中の上清と細胞ペレットを除去し、懸濁液ミキサーを使用して4°Cで30分間回転させます。
5. 細胞溶解物を15,000 x gで15分間遠心分離し、上清を収集します。
6. tag-K-bZIPを精製するには、細胞ライセート(10 mL)を50 μLの抗体タグ付き磁気ビーズと14 mLポリプロピレンチューブでインキュベートし、懸濁液ミキサーを使用して50 rpmで4°Cで3時間回転させます。タンパク質捕捉後、ビーズを800 x g遠心分離で4°C、30秒間ペレット化し、上清の大部分を除去し、ビーズを約1 mLの残留容量に再懸濁し、1.5 mLチューブに移して洗浄します。
7. ビーズの入ったチューブを磁気スタンドに置いて捕捉したタンパク質を洗浄し、磁気ビーズがチューブの側面に完全に付着したら上清を取り除きます。
8. ビーズを溶解緩衝液で4回洗浄します。
   1. 1 mLの溶解バッファーを1.5 mLチューブに加え、チューブを10回反転させます。1.5 mLチューブをマグネットスタンドに置き、2.7の説明に従って上清を取り除きます。
   2. 前の手順をさらに3回繰り返します。
9. ビーズをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度洗浄します。
   1. 1.5 mLチューブに1 mLのPBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄、1.5 mM KH₂PO₄)を加え、チューブを10回反転させます。
   2. 1.5mLチューブをマグネットスタンドに置き、上清液を取り除きます。
10. PBSで希釈した150 μg/mLオクタペプチド100 μLを1.5 mLチューブに添加し、抗体タグ付き磁気ビーズからタグ-K-bZIPタンパク質を溶出します。室温の懸濁液ミキサーによって50rpmで10分間チューブを回転させます。次に、チューブをマグネットスタンドに戻し、K-bZIPを含む上清をきれいな1.5mLチューブに集めます。
11. 1-5 μLの精製タグK-bZIPタンパク質をSDS-PAGEで解析し、続いてクマシーブルー染色を行います。ウシ血清アルブミン(BSA)の2 μg、1 μg、0.5 μgのサンプルを同じゲルにロードし、ImageJなどの画像処理プログラムで定量に使用します。BSA標準と比較して、K-bZIP濃度を推定します。
12. 精製されたK-bZIPは、各SUMO化アッセイで使用する準備が整いました。K-bZIP in PBSを最終濃度100 ng/μLに希釈し、-80°Cで少量アリコートで保存します。

3. SUMOイル化アッセイ

3
1. μLの100 ng/μLの精製タグ-K-bZIPを、各in vitro SUMOイル化反応のマスターミックスに加えます。マスターミックス中の成分には、1 μL タンパク質バッファー、1x SUMOylation バッファー、0.5 μL p53 タンパク質 (0.5 mg/mL)、25 nM の E1 活性化酵素 (ストック濃度: 1 μM)、50 nM の E2 結合酵素 (ストック濃度: 10 μM)、および 250 nM の SUMO ペプチド (SUMO-1、SUMO-2、または SUMO-3; ストック濃度: 5 μM)を最終容量17 μLまで。
2. 内容物を穏やかに混合し、反応を30°Cで3時間インキュベートし、20 μLの2x SDS-PAGEローディングバッファー(100 mM Tris-HCL pH 6.8、4%ドデシル硫酸ナトリウム、0.2%(w/v)ブロモフェノールブルー、20%(v/v)グリセロール、および200 mM β-メルカプトエタノール)を加えて反応を停止し、サンプルを95°Cで5分間変性させます。
3. SDS-PAGE上で試料を分離し、分離したタンパク質をセミドライ電気泳動転写装置を用いてPVDFメンブレンに転写し、抗p53抗体を用いたウェスタンブロットで解析します。
   1. ゲル装置をセットし、20 μLのサンプルをゲルウェルにロードします。
   2. 10%ゲルを80Vの定電流で約120分間(色素バンドがゲルの底に達するまで)運転します。電気泳動終了後、電源をOFFにしてください。
   3. ゲル装置とゲルカセットを取り外してゲルを取り出し、ゲルをセミドライトランスファーバッファー(48 mM Tris-HCl、39 mM グリシン、20%メタノール)に5分間浮かべます。
   4. 別の容器を取り、PVDFメンブレンをメタノールに1分間浸します。次に、メタノールからPVDFを取り出し、セミドライトランスファーバッファーに入れます。メンブレンを5分間静かに攪拌します。
   5. セミドライ電気泳動装置の安全カバーを取り外します。
   6. 濾紙を予め濡らし、底部のプラチナアノードに次のようにゲルサンドイッチを準備します:濾紙、PVDF膜、ゲル、および濾紙。
   7. 陰極板と安全カバーを固定し、15V定電流で90分間ブロットを流し、電源を切り、セミドライ装置を切断し、PVDFメンブレンを取り出します。
   8. ブロッキングバッファー(TBSTバッファー(137 mM NaCl2、20 mM Tris-HCl、0.1%界面活性剤B(材料表を参照)、pH 7.6))を含むブロッキングバッファー(5%脱脂乳)を含むブロックPVDFメンブレンを室温で1時間、オービタルシェーカーで30rpm振とうします。
   9. PVDFメンブレンをブロッキングバッファーで希釈(1:1,000)した抗p53抗体とハイブリダイズし、サスペンションミキサーを使用して4°C、30rpm振とうで12〜16時間
   。
   10. PVDFメンブレンを容器に取り出し、TBSTに入れます。PVDFメンブレンをTBSTでさらに2回すすぎます。
   11. PVDFメンブレンをTBSTに30分間浸し、オービタルシェーカーで45rpmを振とうします。
   12. ブロッキングバッファーで希釈(1:4,000)した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合した抗ウサギ抗体とPVDFメンブレンをハイブリダイズし、室温で30rpm振とう、懸濁液ミキサーを用いて30rpmで1時間
   。
   13. 手順3.4.10の説明に従って、PVDFメンブレンはTBSTで3回洗浄します。
   14. サスペンションミキサーを使用して、PVDFメンブレンをTBSTに30分間浸し、45rpmで振とうします。TBSTを取り外し、PBSを添加して、PVDFメンブレンを4°Cで最大12時間保存します。
   15. 増強化学発光基質(ECL基質)試薬1と2を1:1で混合します(材料表を参照)。PBSからPVDFメンブレンを取り外し、ペーパータオルまたは軽量ワイパーで短時間拭き取って余分な水分を吸収し、すぐに各メンブレンの表面に400μLのECL試薬を3〜5分間加えます。余分なECL試薬は、短時間ブロッティングして取り除きますが、メンブレンが完全に乾かないようにしてください。
   16. 発光イメージングシステムまたはオートラジオグラフィーフィルムを使用してブロットを露光します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pFastBacの	インビトゲン	〒10359-016	二重発現バキュロウイルスベクター
pCR2.1-TOPO ベクター	インビトゲン		PCR産物ベクター
コンピテントセル大腸菌DH5α	イースタンバイオテクノロジー	FYE678-80VL	コンピテントE.コリ細胞A
大腸菌DH10Bac	インビトゲン	〒10359-016	コンピテントE.コリ細胞B
ふジーンHD	ロシュ	4709705001	トランスフェクション試薬
オプティMEM	ギブコ	31985062	血清培地の減少
T4リガーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0202S(英語)
CpoI(RsrII)	サーモサイエンティフィック	ER0741
ブルーギャル	サーモサイエンティフィック	B1690	ガラクトシダーゼ基質
IPTGの	シグマ・アルドリッチ	I6758-1Gの
グレースの昆虫媒体	ギブコ	11605094
ウシ胎児血清	ギブコ	10082147
ゲンタマイシン	サーモフィッシャー	15750060
アンピシリン	シグマ・アルドリッチ	A9393-25Gの
カナマイシン	シグマ・アルドリッチ	K0254-20ミリリットル
ゲンタマイシン	ギブコ	15710-064
テトラサイクリン	シグマ・アルドリッチ	87128から25G
LBブロス	メルク	1.10285.0500
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H4034-100G(英語版)
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S9888-5KG
KClの	メルク	1.04936.1000
Na2HPO4	シグマ・アルドリッチ	S5136-500G
KH2PO4	J.T.ベイカー	3246から01
ドデシル硫酸ナトリウム	メルク	1.13760.1000
β-メルカプトエタノール	バイオ・ラッド	〒161-0710
TRIS (ベース)	J.T.ベイカー	4109から06
無脂肪乳	フォンテラ
グリセロール	J.T.ベイカー	2136-01
トリトンX-100	アムレスコ	0694-1L	洗剤A
トゥイーン 20	アムレスコ	0777〜500ミリリットル	洗剤B
Poloxamer 188ソリューション	シグマ・アルドリッチ	5556-100ミリリットル	洗剤C
プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット	ロシュ	04 693 132 001
3x Flagペプチド	シグマ	F4799
anti-FLAG m2磁気ビーズ	シグマ・アルドリッチ	M8823	抗体タグ付き磁気ビーズ
SUMOlink SUMO-1 キット	アクティブモチーフ	40120	標準SUMO化プロトコル
SUMOlink SUMO-2/3 キット	アクティブモチーフ	40220	標準SUMO化プロトコル
QIAquickゲル抽出キット	キアゲン	28704
QIAGEN プラスミド ミニ キット	キアゲン	12123	プラスミド抽出キット
ポリプロピレンチューブ	隼	352059
ペトリ皿	隼	351029
セルリフター	コーニング	CNG3008
ローディングのヒント	ソレンソン・バイオサイエンス	28480
ポリフッ化ビニリ	パーキンエルマー	NEF1002
ブロッティング濾紙	バイオ・ラッド	1703932
ミニスラブゲル装置 (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	バイオ・ラッド	1658001 EDU
トランスブロットSDセミドライ電気泳動トランスファーセル	バイオ・ラッド	1703940
Pierce ECL ウェスタンブロッティング	熱	32106	ECL試薬
サスペンションミキサー	デジシステム・ラボラトリー・インスツルメンツ株式会社	SM-3000
オービタルシェーカー	カンシンインスツルメンツ株式会社	OS701
ImageQuant LAS 4000 (英語	GEヘルスケア	28955810
生体分子イメージャー	GEヘルスケア	28955810
SF9	サーモサイエンティフィック	B82501
抗P53抗体	細胞シグナル伝達	#9282
抗ウサギ抗体	GEヘルスケア	NA934-1ミリリットル

の さん の シリーズ さん の )