蛍光マイクロプレートベースのシクロヘキシミドChaseアッセイ:蛍光核ミスフォールドタンパク質の分解速度を監視する技術

要約

出典: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の核で発現する蛍光標識されたミスフォールドルシフェラーゼ変異タンパク質の分解動態を研究するためのin vitro蛍光ベースのマイクロプレートアッセイについて説明しています。このアッセイでは、蛍光変異タンパク質を発現する細胞を翻訳阻害剤およびプロテアソーム阻害剤で処理し、ミスフォールドタンパク質のプロテアソーム媒介分解を評価します。

プロトコル

1. 試薬の調製

1. マイクロプレート蛍光リーダーを使用したアッセイ用の低蛍光DMEM培地を調製します。25 mMグルコース、0.4 mMグリシン、0.4 mMアルギニン、0.2 mMシステイン、4.0 mMグルタミン、0.2 mMヒスチジン、0.8 mMイソロイシン、0.8 mMロイシン、0.8 mMリジン、0.2 mMメチオニン、0.4 mMフェニルアラニン、0.4 mMセリン、0.8 mMトレオニン、0.078 mMトリプトファン、0.4 mMチロシン、0.8 mMバリン、1.8 mM CaCl₂、0.81 mM MgSO₄、 5.33 mM KCl、44.0 mM NaHCO₃、110 mM NaCl、0.9 mM NaH₂PO₄。HClまたはNaOHを使用して溶液のpHをpH7.4に調整します。ろ過によって培地を滅菌します.
   手記：この培地には、Fe(NO₃)₃、ビタミン、フェノールレッドが省略されている以外は、高グルコースの標準的なDMEM培地の成分が含まれています。通常のDMEM培地中のフェノールレッド、リボフラビン、ピリドキサールは、蛍光シグナルの検出を著しく妨げます。これらの成分を含まない培地は、生細胞GFPイメージングを成功させるために重要です。培地は冷蔵保存で12ヶ月間安定しています。

2. 蛍光マイクロプレートリーダーを用いたNLS-luciferase-GFPのリアルタイム分解アッセイ

1. 約1 x 10⁴ HeLa細胞を、底が透明な黒色の96ウェル組織培養プレートに播種します。O/N培養後、トランスフェクション時には50-70%のコンフルエンスに達します
   注:完全に懸濁したHeLa細胞を含む60μlの培地を各ウェルに直接播種します。播種後、培地や岩板を前後に追加しないでください、そうしないと、細胞が不均一に分布する可能性があります。
2. 0.05-0.1 μgのNLS-ルシフェラーゼ-GFP/pRK5プラスミドを含むHeLa細胞を、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用して各ウェルにトランスフェクションします。DNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクションミックスを作製し、ウェルごとに分注します。細胞を含む3つのウェルにはDNAがトランスフェクションされていないため、各治療条件のバックグラウンド蛍光シグナルのコントロールとして機能します
   手記： トランスフェクションの変動を減らす別の方法は、播種前に細胞をトランスフェクションすることです。しかし、誤って折りたたまれたタンパク質をトランスフェクトした細胞の大部分は、この方法では接着できなかったり、生存率が低下したりします。一部の細胞は、有毒なミスフォールドタンパク質を発現する際にトリプシン消化によって引き起こされるストレスに耐えられない可能性があります。その結果、全体的な蛍光シグナルが大幅に減少します。
3. トランスフェクションの20-24時間後、逆型蛍光顕微鏡で生細胞を検査し、励起波長450-490 nmのGFP発現を確認します。
4. 真空吸引で媒体を取り除きます。各ウェルに約200 μl 1x PBSを添加し、吸引してDMEM培地の残留量を除去します。
5. 60 μlの低蛍光DMEM培地に5% FBSおよび50 μg/ml CHXを加えます。プロテアソームの分解を調べるには、1セットのサンプルに追加のプロテアソーム阻害剤MG132(10μM)を含めます。各治療/状態ごとにウェルを3倍に設定します.
   手記：MG132治療は、細胞死や蛍光消光など、蛍光シグナルの低下を引き起こす可能性のある他の要因を除外することが重要であるため、プロテアソーム分解のコントロールとして含まれています。
6. CHXを添加した後、蛍光プレートリーダーでGFPの蛍光シグナルをすぐに測定します.
   手記： ソフトウェア測定設定を表1に示します。
7. プレートを1時間ごとに最大8〜10時間読み取ります。読み取った後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
8. データをスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。各ウェルのマルチリードの平均値と蛍光強度を使用します。各データ ポイントの値を、それぞれのグループの Time 0 の平均値に正規化します。図1Aと図1B、および図2の右パネルに示すように、正規化された蛍光強度を経時的にプロットします。
9. 反復測定を伴う二元配置ANOVAを使用して、2つの条件間の劣化率の統計分析を実行します.
   手記： この解析では、「蛍光強度」が従属変数であり、「治療条件」と「時間」が2つの要因です。個々の時点でデータを比較する代わりに、反復測定を伴う二元配置分散分析は、全時間経過にわたる2つの治療グループ間の差を分析します。

表1:蛍光マイクロプレートリーダーでの測定設定。

の の の の

プレート定義ファイル		GRE96FBの
測定モード		蛍光強度ボトム
>波長	励起波長	485 nm
	励起帯域幅	9 nm
	発光波長	535 nm
	エミッション帯域幅	20 nm
フラッシュの数		5
>ゲイン		マニュアル 200
>積分時間		20μ秒
ウェルごとに複数の読み取り	種類	サークル(塗りつぶされた)
	大きさ	5×5
	境	400μm

結果

図1:NLS-LucDM-GFP分解のための蛍光マイクロプレートベースのアッセイ。96ウェルプレートに播種したHeLa細胞に0.05 μg(A)または0.1 μg(B)のNLS-LucDM-GFPをトランスフェクションし、MG132の存在下または非存在下でCHXで処理しました。(AおよびB)ウェルの蛍光強度は、示された時点(平均値±標準偏差、n = 3)で測定されました。左側のパネルは元の蛍光測定値を示し、右側のパネルは、それぞれの治療群の時間 0 での読み取り値に正規化された値を示しています。MG132 で治療されたグループと治療されなかったグループの違いを、反復測定による 2 因子分散分析によって分析しました。2つの治療群間のP値を示します。(

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	ライフテクノロジー	11995年092
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	10082147
リポフェクタミン 2000	ライフテクノロジー	11668019
MG132	シグマ・アルドリッチ	M8699
アミノ酸	シグマ・アルドリッチ		アミノ酸は低蛍光培養培地を作るために使用されます
シクロヘキシミド	シグマ・アルドリッチ	C7698
オリンパスIX-81倒立型蛍光顕微鏡	オリンポス	IX71/IX81
96ウェルブラックTCプレート、半透明クリアボトム付き	シグマ・グライナー	〒89135-048
蛍光ボトムプレートリーダー Infinite 200® PRO	テカン	インフィニット200®プロ
プリズム5	グラフパッド		統計解析ソフトウェア