細胞ベースのAAV中和抗体アッセイ:血清中の特定のアデノ随伴ウイルスに対する中和抗体を検出するための比色技術

要約

出典: Bass-Stringer, S., et al. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (2021年)

このビデオでは、ヒツジの血清サンプル中のアルカリホスファターゼ発現組換えアデノ随伴ウイルス血清型6(rAAV6)ベクターに対する中和抗体の存在を検出するためのin vitro比色アッセイを実演しています。このアッセイは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子をコードするAAVとその基質との間の反応を利用して、不溶性の紫色の生成物を生成します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

アッセイプロトコルの概略概要を図1に示します。

1. 初期準備

1. ヒツジでの評価の場合:8 mLの血清セパレーター血栓活性化チューブ(材料の表を参照)に血液を採取し、血液サンプルを室温(RT)で20〜30分間放置し、その後、2,100 x gで15分間スピンダウンします。チューブの上部に形成される透明な上澄み液が血清です。透明な水相をマイクロ遠心チューブに分注し、-80°Cで保存します
   手記：-80°Cの血清は~5年間安定しています。血液は、意識のある動物からの16G針(先端カットオフ)と注射器を使用して頸動脈静脈から採取されました。
2. 56°Cの水浴に30分間入れて不活化ウシ胎児血清(FBS)を加熱し、断続的に渦巻きます。精度を上げるには、同量の水が入った2本目のボトルに温度計を入れ、FBSボトルと同時にヒートバスに加えます。温度計が56°Cに達したときにタイミングを開始します。
3. 細胞培養フードで実施される後続のすべてのステップについて、適切な無菌技術と細胞培養の実践を採用します。使用前にすべての物体とフードに70%エタノールをスプレーし、完了したら1%次亜塩素酸ナトリウムで清掃します。
4. 高グルコース(4.5 g / L)DMEM(89%)と熱不活化FBS(10%)およびペニシリンストレプトマイシン(1%)を組み合わせて、ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)を完全に作ります。滅菌真空ろ過システム(0.22 μmの孔径、ポリエーテルスルホン膜)を使用して組み合わせ、ろ過します(材料の表を参照)。完全なDMEMはホイルで包まれ、4°Cで保存してください。
5. HT1080セル(材料の表を参照)を樹立し、75 cm²正方形のフラスコで通過させます。細胞の凍結ストックを複数作成します。20回の継代後には、さらなる継代がアッセイ結果に影響を与える可能性があるため、細胞を使用しないでください。

2. 1日目 - 細胞のめっき

1. HT1080細胞が~80%のコンフルエント度に達したときに継代します。
2. 完全DMEM(ステップ1.4で調製)、0.05%トリプシン-EDTA、および1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を水浴中で37°Cに予温します。吸引システムを使用して継代細胞から増殖培地を取り出します.
   手記：このプロトコルのすべての吸引は、滅菌済みの5mL血清ピペットにチューブが取り付けられた真空システムを使用します。
3. 10 mLの予熱済み(37°C)1x PBSで細胞を洗浄し、予熱済みの0.05%トリプシン-EDTAの4 mLで細胞を3〜4分間トリプシン化して、フラスコから細胞を剥離します。
4. 予熱した完全DMEMを6 mL添加してトリプシンを不活性化し、細胞を50 mLチューブにピペットで移します。血球計算盤とトリパンブルー排除法を使用して、生細胞の数と濃度を計算します。
5. 細胞を1 x 10⁵細胞/mLの濃度に希釈し、予め温めた完全DMEMで調製します。100 μLの細胞/ウェルを透明な96ウェル平底プレート(1ウェルあたり1 x 10⁴細胞)に播種します。プレートを37°C、5%二酸化炭素(CO₂)で一晩16〜22時間インキュベー
トします。

3. 2日目 - 細胞への感染

1. インキュベーターからプレートを取り出し、光学顕微鏡を使用して、細胞がウェル内に均一に分散していること、およびコンフルエントが~50%であることを確認します。細胞が45%〜55%のコンフルエントの範囲内にない場合は、「Day 1」プロトコルを繰り返し、それに応じて初期細胞濃度を調整します。
2. 希釈液として予熱した完全DMEMを使用して、1.5 mLの微量遠心チューブで目的の血清サンプルの段階希釈液を生成します。表1は、トリプリケートサンプルの希釈カスケードの生成を示しています。
   1. アッセイを3回に分けて行うには、ウイルスストック溶液を1x PBSで希釈して、AAV6-hPLAPの7.5 x10⁶ベクターゲノム(vg)/μLのワーキング溶液(材料表を参照)を調製します。
   2. 264 μL の血清/培地希釈液 (330 μL の総容量/希釈液、表 1 を参照) が入った各チューブに 7.5 x 10⁶ vg/μL のウイルスワーキング溶液 66 μL を加えます。
      手記：これは、完璧な培養条件を必要としない堅牢なアッセイです。ただし、各アッセイランを正確に定量し、信頼性を確保するためには、(1)ウイルスと培地のみのコントロール、(2)培地のみのコントロール、および(3)同じ実験条件下ですべてのプレートにNAb陽性コントロールサンプルを含める必要があります。記載されている容量(330 μL)は、血清とウイルスの混合物の三重サンプル+10%を占めています。中和活性を正確に測定するためには、反復を実行することを強くお勧めします。
3. ピペッティングでウイルス/血清希釈液を混合し、ウイルス/血清混合物を含むチューブをインキュベーターに37°C、5%CO₂で30分間置いて、中和の可能性を待ちます。
4. 100 μL のウイルス/血清混合物を、希釈ごとに 1 x 10⁴ 細胞/ウェルを含む 96 ウェルプレート上の各ウェルにピペットで移します。
   手記：これにより、各ウェルで15kウイルス/細胞感染多重度(MOI)の最終的なウイルス濃度が生成されます。表 2 は、サンプルを 1/512 希釈まで評価するための 96 ウェルサンプルプレートレイアウトの例を示しています。
5. 細胞、血清、AAV-hPLAPを含む96ウェルプレートをホイルで包み、37°C、5%CO₂のインキュベーターに16〜24時間一晩置いて、AAVが細胞に入るようにします。

4. 3日目 - 細胞への基板の固定と追加

1. 1x PBSのアリコートを37°C(~25 mL/96ウェルプレート)に予温します。PBS(~25 mL/96ウェルプレート)と再蒸留H₂O(重水素減少水、~25 mL/96ウェルプレート)の分離アリコートを4°Cに冷却し、BCIP/NBTのペレット(材料表を参照)をボルテックスにより50 mLの円錐形遠心チューブ内の10 mLの重水素減少水に溶解します(10 mLは2 x 96ウェルプレートに十分です)。
2. 吸引ベースの吸引システムまたはドラフト掃除機に取り付けられた血清ピペットまたは同様のものを使用して、96ウェルプレートのウェルから培地を吸引します。血清ピペットの先端をウェルにそっと入れ、接着した細胞を乱さないように注意しながら培地を取り出します。
   1. ピペットを使用して、各ウェルに50 μLのRT 4% PFAを加えます。プレートをホイルで包み、室温で10分間放置して細胞を固定します
      注意：パラホルムアルデヒド(PFA)は発がん性が高い物質であり、皮膚や眼への接触、吸入により毒性を示します。適切な個人用保護具とフェイスマスクを備えたドラフトで取り扱ってください。PBSで希釈した新鮮な4% PFAを調製します(96ウェルプレートあたり~7 mLが必要)。
3. 細胞を200 μLのRT 1x PBSで洗浄し、吸引します。この手順を 2 回繰り返します。
   手記：マルチチャンネルピペットは、ピペッティングステップの効率的なオプションです。
4. 予熱したPBS200 μLを各ウェルにピペットで入れ、プレートをホイルで包み、65°Cで90分間インキュベートして、内因性アルカリホスファターゼ活性を変性させます。
5. ウェルを吸引し、200 μLの冷(4 °C)PBSで細胞を洗浄します。再度吸引し、200μlの冷たい重水素水で洗浄し、再度吸引します。
6. 溶解したBCIP/NBT(ステップ4.1で調製)を50μLを各ウェルにピペットで移します。
7. プレートをホイルで包み、室温で2-24時間
   インキュベートします。 手記：実行間のインキュベーション時間に一貫性を持たせてください。時間の柔軟性により、ユーザーは3日目または翌日に井戸を撮影できます。
8. 光学顕微鏡カメラを使用して、4倍対物レンズを使用して各ウェルの写真を撮り、実施するすべてのアッセイで同じ露光、ホワイトバランス、および光設定が一貫して使用されることを確認します。
   1. 各ウェルを同じように配置し、ウェルの端が写真に写らないようにします。TIF形式などで写真を保存します.
      手記：具体的な設定は顕微鏡によって異なりますが、ウェル全体で背景照明が強く、一貫している場合に、定量が最も効果的になります(図1B)。

>表1:血清の段階希釈を三重に生成するために必要な血清と希釈液の量。

日

希釈カスケードラベル	希釈	3 x サンプル (240 μL) + 10% バッファー容量 (24 μL)	血清:培地の比率
希釈率1(D1)	1月2日	264 μL 血清 264 μL 培地	50:50
希釈率 2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL メディア	25:75
希釈度3(D3)	1月8日	264 μL D2 +264μL メディア	12.5:87.5
希釈率4(D4)	1月16日	264 μL D3 +264 μL メディア	6.25:93.75
希釈率5(D5)	1月32日	264 μL D4 +264 μL メディア	3.13:96.87
希釈率 6 (D6)	1月64	264 μL D5 +264 μL メディア	1.56:98.44
希釈度 7 (D7)	1/128	264 μL D5 +264 μL メディア	0.78:99.22
希釈率 8 (D8)	1/256	264 μL D5 +264 μL メディア	0.39:99.61
希釈率9(D9)	1/512	264 μL D7 + 264 μL メディア	0.2:99.8
希釈率 10 (D10)	2048年1月	132 μL D8 + 396 μL メディア	0.05:99.95
希釈度 11 (D11)	1/8192	132 μL D9 + 396 μL メディア	0.01:99.99
希釈度 12 (D12)	1/32768	132 μL D10 + 396 μL メディア	0.003:99.997

>表2:1/2から1/512の範囲の希釈液でナイーブ血清サンプルを評価するための96ウェルプレートレイアウトの例。 AAV NAbsに対して陽性であることが知られているサンプル(投与後サンプル)を評価する場合、またはより高い力価が必要な場合は、より高い希釈率がアッセイに組み込まれます。MO (-C): メディアのみの制御。VO (+C): ウイルスとメディアのみの制御。mAb:AAVに対するモノクローナル抗体(NAbポジティブコントロール)。

>血清サンプル #1

>血清サンプル #2

>血清サンプル #3

モノラルAB(mAB)、コントロール、追加サンプル

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng MAbの

50 ng MAbの

50 ng MAbの

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng MAbの

5 ng MAbの

5 ng MAbの

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng MAbの

0.5 ng MAbの

0.5 ng MAbの

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

サンプル #1 1/512

サンプル #1 1/512

サンプル #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

サンプル #2 1/512

サンプル #2 1/512

サンプル #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

サンプル #3 1/512

サンプル #3 1/512

サンプル >#3 1/512

結果

図1:NAbアッセイプロトコルの概略図。(A)3日間のプロトコルに関与する主要なステップを示すNAbアッセイの視覚的表現。簡単に言うと、細胞を増殖させ、一晩で播種します。翌日、血清の段階希釈液を調製し、AAVとインキュベートした後、細胞と一晩インキュベートします。翌日、細胞を固定し、洗浄し、インキュベートし、基質と結合し、再度インキュベートした後、イメージングと定量を行います。(B)最小シグナル制御(完全なAAV阻害)、最大シグナル制御(阻害なし)、および~50%のシグナル阻害を持つヒツジ血清サンプルの代表的な画像。スケールバー= 0.5 mm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05%トリプシン/ EDTA	ギブコ	〒25300-054
50 mLコニカル遠心チューブ	隼	14-432-22	または同等のもの
75 cm2 正方形のフラスコ	隼	353136	または同等のもの
96ウェル平底プレート	隼	353072
AAV6-CMV-hPLAP ベクトル			Muscle Research & Therapeutics Lab (メルボルン大学、オーストラリア) AAV6-CMV-hPLAPは、ご要望に応じて提供可能です。
アルミホイル
抗AAV6(無傷粒子)マウスモノクローナル抗体(ADK6)	プロゲン	610159	ポジティブコントロールモノクローナル抗体
BCIP/NBTの	シグマファスト	B5655
細胞および組織培養用安全キャビネット
電動ピペット			5 mL & 10 mL ストリペットインサート
ウシ胎児血清	ギブコ	10099-141
血球計算盤
高グルコースダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)	ギブコ	11965118
HT1080セル	ATCCの
孵卵器			37 °C、5% CO2
カメラ付き光学顕微鏡			4倍の対物レンズで撮影可能
オーブン			65°Cのインキュベーション用
パラホルムアルデヒド	メルク	30525-89-4
ウォーターバス
ペニシリンストレプトマイシン	ギブコ	15140-122