In vitro Persister Assay:細菌の持続性に対する浸透圧の影響を評価する方法

要約

出典:Karki, P. et al. ハイスループットスクリーニングによる化合物の細菌持続性への影響の解明 J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、浸透圧が細菌の残留物の形成に及ぼす影響を評価する方法を示します。細菌細胞は、最初に浸透圧ストレスを誘発するために浸透圧に曝露され、持続性の形成を引き起こし、次に抗生物質で処理されて残留性物質を列挙します。

プロトコル

1. 増殖培地、オフロキサシン溶液、大腸菌細胞ストックの調製

1. 通常のルリア・ベルターニ(LB)培地:脱イオン(DI)水に10 g/Lのトリプトン、10 g/Lの塩化ナトリウム(NaCl)、5 g/Lの酵母抽出物を加えます。オートクレーブで培地を滅菌します。
2. LB寒天プレート:10 g/Lのトリプトン、10 g/LのNaCl、5 g/Lの酵母抽出物、および15 g/Lの寒天をDI水に加え、オートクレーブして培地を滅菌します。希望の温度(~55°C)で、~30 mLの寒天培地を角型プレート(10 x 10 cm)に注ぎます。プレートを乾燥させ、4°Cで保存します。
3. 変性LB培地:10 g / Lのトリプトンと5 g / Lの酵母抽出物を脱イオン水に加えます。.オートクレーブで培地を滅菌します。
4. 浸透圧を含む改質LB培地:2倍改質LB培地と2倍浸透圧溶液を等量で混合します。2倍修飾LB培地を調製するには、20 g/Lのトリプトンと10 g/Lの酵母抽出物を脱イオン水に加え、オートクレーブ滅菌します。2倍浸透圧溶液を調製するには、目的の浸透圧をDI水(2倍量)に溶解し、溶液をろ過滅菌します。
   手記：目的の浸透圧とその濃度は、Phenotype Microarrayスクリーニングアッセイ(プロトコル4を参照)から決定できます。ただし、試験した浸透圧とそれに関連する2倍の濃度は、研究の性質に応じて調整することができます。例えば、1 mM塩化ナトリウムの影響を研究するには、2倍浸透圧溶液を2 mM塩化ナトリウム溶液とします。
5. オフロキサシン原液(5 mg / mL):1 mLの脱イオン水に5 mgのオフロキサシン(OFX)塩を加えます。.10 μLの10 M水酸化ナトリウムを添加して、OFXの水への溶解度を高め、溶液をろ過滅菌します。アリコートを調製し、-20°C.
   で保存します。 手記：オフロキサシンは、成長する細菌細胞と成長しない細菌細胞の両方に広く使用されているキノロン系抗生物質です14,21。 大腸菌MG1655細胞に対するOFXの最小阻害濃度(MIC)は、0.039〜0.078μg/mLの範囲です。また、アンピシリンやカナマイシンなどの他の抗生物質は、持続性研究で一般的に使用されていることに注意してください。抗生物質の選択は、研究の性質によって異なります。
6. 大腸菌MG1655細胞ストック:14 mLの試験管(スナップキャップ付き)に2 mLのレギュラーLB培地に1つのコロニーを接種し、オービタルシェーカーで細胞を250 rpmおよび37°Cで培養します。細胞が固定相に達したら、500 μLの細胞培養液と500 μLの50%グリセロール(滅菌)を極低温バイアルで混合し、-80°Cで保存します。

2. 既存の永続性を排除するための細胞の増殖

1. 一晩培養を調製するには、滅菌ピペットチップで凍結細胞ストックから少量の細胞を掻き取り(グリセロール細胞ストックを解凍しないでください)、14mLのスナップキャップ付き試験管で2mLの改変LB培地に細胞を接種します。オービタルシェーカーで細胞を250rpm、37°Cで12時間培養します。
2. 最初の伝播
   1. 12時間後、250 μLの一晩培養液を、滅菌アルミホイルで覆われた250 mLのバッフルフラスコに入れた25 mLの新鮮な改変LB培地に移します。
   2. 細胞が中指数相(OD₆₀₀ = 0.5)に達するまで、250 rpmおよび37°Cのオービタルシェーカーで細胞培養を増殖させます。
   3. マイクロプレートリーダーを使用して、600 nm(OD₆₀₀)での光学濃度を30分ごとに測定します。
3. 2回目の伝播
   1. OD₆₀₀ = 0.5で、最初のフラスコから採取した250 μLの細胞培養液を、250 mLのバッフルフラスコで25 mLの新鮮な改変LB培地に希釈します。
   2. 2番目の細胞培養物をオービタルシェーカーで250rpm、37°CでOD₆₀₀ = 0.5になるまで増殖させます。
   3. 30分ごとに光学密度を測定します.
      手記：一晩培養すると、かなりの量の持続性細胞が含まれる場合があります。上述の希釈/増殖サイクル法は、細胞をマイクロアレイに移す前に、これらの既存の持続性を排除するために使用することができる。それらの除去は、プロトコル3に記載されているアッセイを用いて、オーバーナイト培養物の持続性レベルを定量化することによって検証することができます。

3. 既存の永続性細胞の除去の検証

1. 2回目の増殖後(ステップ2.3を参照)、250 mLのバッフルフラスコに250 mLの新鮮な改変LB培地25 mLで細胞培養液(OD₆₀₀ = 0.5)を希釈します><。 手記： コントロールの場合は、250 mLのバッフルフラスコに入れた25 mLの新鮮な改変LB培地で、250 μLの一晩培養(ステップ2.1を参照)を希釈します。細胞をフラスコに移す前に、一晩培養する細胞密度を新鮮な改変LB培地で調整して、OD₆₀₀ = 0.5を得る必要があります。
2. 25 μLのOFXストック溶液(5 mg/mL)を細胞懸濁液に加え、フラスコを静かに振とうして、アッセイ培養を均一にします。OFXの最終濃度は、アッセイ培養物中で5 μg/mLです。
3. アッセイ培養物をオービタルシェーカーで250rpm、37°Cでインキュベー
トします。
4. 処理中の1時間ごと(アッセイ培養物にOFXを添加する前の時点である0時間を含む)に、フラスコから1.5mLの微量遠心チューブにアッセイ培養物1mLを移します。
5. 微量遠心チューブ内でアッセイ培養物を17,000 x gで3分間遠心分離します。
6. 細胞ペレットを乱さずに、950μLの上清を慎重に取り除きます。
7. 950 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を微量遠心チューブに加えます。
8. 抗生物質濃度が最小阻害濃度(MIC)を下回るまで、洗浄手順3.5〜3.7を合計3回繰り返します。.
9. 最終洗浄後、細胞ペレットを100 μLのPBS溶液に再懸濁すると、10倍濃縮されたサンプルが得られます。
10. 10 μLの細胞懸濁液を取り出し、96ウェル丸底プレートを使用して90 μLのPBS溶液で6回連続希釈します。
11. 希釈した細胞懸濁液10 μLを、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートでスポットします。検出限界を上げるには、残りの90 μLの細胞懸濁液を新鮮な寒天プレートにプレートします。
12. 寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、コロニー形成単位(CFU)をカウントします。1 mLのアッセイ培養物中のCFUの総数を計算する際に、希釈速度を考慮してください。キルカーブは、抗生物質治療の期間に対する対数CFU値をプロットすることによって生成されます.
    手記： 6時間のOFX処理は、大腸菌細胞の二相性殺傷曲線を得るのに十分です。増殖した細胞の持続性レベル(6時間でのCFUカウントで測定)は、一晩培養した場合よりも大幅に低くなければなりません。プロトコール2および3に記載されている手順は、研究デザインに応じて通常のLBで実行できます。

4. マイクロアレイプレートのスクリーニング

1. マイクロアレイ細胞培養の調製
   1. 250 μL の指数期細胞を 25 mL の新鮮な改変 LB 培地 50 mL の遠心チューブに移します。細胞懸濁液を穏やかに混合して均一にします.
      手記：指数位相セル(OD₆₀₀ = 0.5)は、2番目の伝播ステップ(ステップ2.3を参照)から取得されます。
   2. 希釈した細胞懸濁液を滅菌済みの50mLリザーバーに移します。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、150 μLの細胞懸濁液をマイクロアレイの各ウェル、つまりさまざまな浸透圧を含む96ウェルプレートに移します
      手記：浸透圧を含まない井戸がコントロールとして機能します。
   4. マイクロアレイをガス透過性のシーリングメンブレンで覆います。
   5. プレートをオービタルシェーカーで37°C、250rpmで24時間インキュベートします
      手記：これらの実験では、さまざまな浸透圧、pH緩衝液、その他の化学物質をさまざまな濃度で乾燥させた状態のPhenotype Microarrays(PM-9およびPM-10)などの市販のプレートを使用しました。これらのマイクロアレイは、ハーフエリアの96ウェルプレートフォーマットです。培養量は、使用するプレートの種類に応じて調整する必要があります。マイクロアレイは手動で生成することもできます。
2. マイクロアレイプレートの手動調製
   1. 75 μLの2倍浸透圧溶液をハーフエリアの96ウェルプレートのウェルに移します。
   2. 500 μLの指数期細胞を、50 mLの遠心チューブで2x改変LB培地25 mLに移します。細胞懸濁液を穏やかに混合して均一にします.
      手記：接種率は、4.1に記載されているマイクロアレイスクリーニングプロトコルと一致するように調整されました。
   3. 2x浸透圧溶液を含むハーフエリア96ウェルプレートの各ウェルに、75 μLの細胞懸濁液を加えます。
   4. プレートをオービタルシェーカーで37°C、250rpmで24時間インキュベートします。
3. パーシスタンスターアッセイプレートの調製
   1. 50 mLの遠心分離チューブに5 μg/mLのOFXを含む25 mLの改変LB培地を調製し、この培地を滅菌リザーバーに移します。
   2. マルチチャンネルピペットを使用して、190 μLの改質LB培地をOFX入りリザーバーから一般的な平底96ウェルプレート(パーシスターアッセイプレート)の各ウェルに移します。
   3. マイクロアレイをシェーカーから取り出し(24時間培養後)、マイクロアレイから10μLの細胞培養物を、OFXを含む修飾LB培地を含むパーシスターアッセイプレートのウェルに移します。
   4. パーシスターアッセイプレートから10 μLの細胞懸濁液を取り出し、丸底の96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用して、290 μLのPBS溶液で3回段階希釈します。
   5. 段階希釈後、マルチチャンネルピペットを使用して、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレート上で、すべての段階希釈した細胞懸濁液の10 μLをスポットします。
   6. パーシスターアッセイプレート(ステップ4.3.3で調製)をオービタルシェーカーで37°C、250rpmで6時間インキュベートした後、プレートをガス透過性シーリングメンブレンで覆います。
   7. シェーカーで6時間インキュベートした後、パーシスタンターアッセイプレートを取り出し、手順4.3.4-4.3.5を繰り返します。
   8. 寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、CFUをカウントします。抗生物質処理前と6時間後のCFUレベルにより、各ウェルの残留性画分を計算できます。OFX処理前のCFUカウントは、浸透圧や大腸菌の生存率への影響を評価するのにも役立ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14ml試験管	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-1B
平底96ウェルプレート	USAサイエンティフィック	〒5665-5161
ガス透過性シーリングメンブレン	VWRの	102097から058	ガンマ線照射による滅菌済みで、細胞毒素を含まない
半面積平底96ウェルプレート	VWRの	82050-062
LB寒天	フィッシャーサイエンティフィック	BP1425-2	分子遺伝学グレード
オフロキサシン塩	VWRの	103466から232	HPLCの≥97.5
表現型マイクロアレイ(PM-9およびPM-10)	バイオログ	該当なし	PM-9プレートとPM-10プレートには、それぞれさまざまな浸透圧とバッファーが含まれていました
丸底96ウェルプレート	USAサイエンティフィック	〒5665-0161
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S271-500	認定ACSグレード
硝酸ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	AC424345000	ACS試薬グレード
亜硝酸ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	AAA186680B	純度98%
スクエアシャーレ	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875711A
トリプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1421-500	分子遺伝学グレード
Varioskan lux マルチモードマイクロプレートリーダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	VLBL00D0	600nmでの光学密度測定に使用
酵母エキス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1422-100	分子遺伝学グレード