蛍光レポーターベースの麻痺アッセイ:線虫Caenorhabditis elegansにおけるポリグルタミン蛍光レポーターの加齢に伴う進行性形成と関連麻痺を評価する技術

要約

出典:Lazaro-Pena, M. I. et al.線虫の組織特異的なタンパク質抑制低下の定量化。J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオは、老化によるプロテオスタシスの低下を決定するためのin vivoイメージングベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ポリグルタミンYFP融合タンパク質を体壁筋に発現する線虫Caenorhabditis elegansを使用して、ポリグルタミンの加齢に伴う凝集と麻痺につながるタンパク質毒性の誘導を測定します。

プロトコル

1. ポリグルタミン発現動物を用いた筋肉組織のプロテオスタシス低下の測定

>注:筋肉細胞のタンパク質うっ滞低下を特定するには、老化中のタンパク質凝集体の形成をイメージングする方法(1.1)と、これらの凝集体が加齢とともに麻痺の発症を通じて引き起こすタンパク質毒性を測定する方法(1.2)の2つの方法を使用できます。

1. 老化期の筋肉におけるポリグルタミン凝集体形成のイメージング
   手記：筋肉細胞におけるタンパク質凝集の加齢依存的な進行は、黄色の蛍光タンパク質(YFP)に融合したポリグルタミン(polyQ)リピートを用いて画像化されます。このプロトコルでは、AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP]株の使用を概説していますが、他のポリグルタミンバリアント株も使用できます。polyQ::YFP導入遺伝子は、unc-54筋特異的プロモーターを用いて筋肉内で発現します。同期したunc-54p::p olyQ::YFP発現動物を成体期の1日目、2日目、3日目、4日目に可視化します。unc-54p::p olyQ::YFP凝集体を可視化するには、蛍光用を備えた複合顕微鏡または蛍光解剖顕微鏡を使用します。AM140は、Caenorhabditis Genetics Center(CGC)から入手できます https://cgc.umn.edu/strain/AM140
   1. イメージングの日(成人期の1日目、2日目、3日目、4日目)に、20匹の動物を選び、3%アガロースパッドと5 μL滴の10 mMアジ化ナトリウム(M9バッファーで希釈)を10 μL滴下して顕微鏡スライドセットアップにマウントします。
   2. すべての動物をアジ化ナトリウムで動けなくした後(~5分)、10倍倍レンズを使用して動物の全身を画像化します(図1A)。イメージングには、FITCフィルターを使用し、すべての動物に同じ露光を使用します。イメージング後にスライドを破棄します.
      手記：あるいは、YFP病巣をプレート上で直接定量化することもできますが、スコアリング中にプレートに二酸化炭素の流れを適用することにより、動きを抑制する必要があります。この代替方法は、多数の条件をスクリーニングする場合に最も適しています。
   3. 画像を取得した後、動物全体の体壁の筋肉の病巣の数を数えます。焦点は、背景の暗い可溶性信号と区別できる、より明るく中断された信号です。
   4. 1日目、2日目、3日目、4日目からのYFP病巣蓄積の進行をプロットします。X が成人期の日数を表し、Y が unc-54p::p olyQ::YFP 病巣の数を表す XY グラフをプロットします (図 1B)。実験条件における病巣の数(例えば、遺伝子のダウンレギュレーションまたは過剰発現)を対照動物と比較する。各試行で観察された各時点で、グループ間で統計分析を実行します。
      1. 2 つの条件についてのみ病巣カウントを比較する場合は、各時点で独立したサンプル t 検定を実行します。
      2. 2 つ以上の条件の焦点カウントを比較する場合は、その時点のすべての条件のデータを含め、各時点のオムニバス一元配置 ANOVA 分析を実行します。オムニバス分散分析で有意なp値(つまり、p < 0.005)が得られた場合は、ペアワイズ独立サンプルt検定を使用して事後分析を実行し、焦点の有意差が検出された特定の条件を特定します(たとえば、グループA、B、およびCグループでA&B、A&C、およびB&Cを比較します)。

2. 筋肉細胞におけるポリグルタミン毒性の代理として動物の麻痺率を測定する

>注:筋肉内のpolyQ凝集体の加齢依存的な増加は、運動を駆動する筋肉機能の低下を引き起こします。この運動障害は、polyQ発現動物の麻痺の進行速度を測定することで判断できます。麻痺アッセイでは、同期した unc-54p::p olyQ::YFP 発現動物を成人期の 3、5、7、および 9 日目に採点します。必要に応じてタイムポイントを追加し、遺伝的摂動の影響を評価できるようにスコアリング範囲を拡張します。

1. 採点日(成虫3日目、5日目、7日目、9日目)に、50匹の動物が入った6cmのプレートを見て、麻痺した動物の数を記録します。麻痺した動物をプレートから取り除きます。動物がプレートから這い出したり、死んだりした場合は、検閲する必要があります。解析で考慮できるようにイベントを記録します.
   手記：動物を光または穏やかな接触刺激にさらした後、動きが観察されない場合、動物は麻痺していると見なされます。咽頭ポンプ活動は、動かない動物が生きているか死んでいるかを判断するために使用されます。
2. 実験が完了したら、各条件の麻痺率を計算します。これは、麻痺した動物の割合をその状態で観察された動物の総数で割ることにより、各時点で行います。各時点の条件ごとに複数のプレートを観察する場合(つまり、レプリケートプレート)、各レプリケートごとに比率を個別に計算します。
3. 麻痺率の進行をXYグラフ(散布図)にプロットします。Xは成人期の日数を表し、Yは麻痺率を表します。unc-54p::p olyQ::YFP動物の麻痺率は、対照動物と比較されます(図1C)。グループ間で統計分析を実行します。複数の試験の場合は、試験を独立して治療します。Cox比例ハザード回帰とWald検定を使用します。生存時間解析をサポートするほとんどのデータ分析ツールは、Cox モデリングもサポートしています。
   1. データを変換します。各条件には、時間用と "イベント" 用の 2 つの列が必要です。観測された各時点で、麻痺した動物ごとに "0" の行を追加し、打ち切られた動物ごとに "1" の行を追加します。行の総数は、その条件のプレート上の開始動物の数と等しくなければなりません。
   2. 統計ソフトウェアの指示に従って、Cox 比例ハザード モデリングを実行し、続いて Wald 検定を実行します。単変量モデルは、一般的な実験計画に適しています。2つ以上の条件について、すべての条件を含むテストが有意な結果(つまり、p < 0.005)を示している場合、条件間のペアワイズテストを実行して、条件の特定の有意なペアを決定できます。
      手記：Cox モデルは、テスト条件が事象の確率を時間経過に比例して調整するという仮定に依存しています。これは、例えば、Coxモデルは、ほとんどの動物が1日目に麻痺している状態と、ほとんどの動物が9日目に麻痺している状態を比較するのに適切ではないことを意味します。Coxモデルの拡張、および各時点で麻痺した比率を比較するための他のアプローチは、比例ハザードの仮定が成り立たない場合に使用できます。

結果

図1:C.エレガンスの筋肉内でのpolyQ::YFPの発現は、老化中に進行性の病巣蓄積と麻痺をもたらします。(A)C.エレガンスは、成人期の1日目と4日目に発現します(それぞれ上段と下段)。矢印は代表的な病巣を示しています。(B)成人期の最初の4日間の蛍光病巣の定量化。病巣はFRAPに耐性があり、不溶性タンパク質凝集体と一致します。エラーバーは、平均(SEM)(C)unc-54p::Q35::YFP動物が老化中に麻痺する標準誤差を表します。エラーバーは、比率の標準誤差を表します。スケールバーは、すべてのパネルで100μmを表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラス顕微鏡スライド	VWRの	160004-422
アジ化ナトリウム、CAS #26628-22-8	シグマ・アルドリッチ	S2002
Zeiss Axio Imager M2m 顕微鏡 (AxioVision v4.8.2.0 ソフトウェア搭載	ツァイス
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad 顕微鏡	ツァイス

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