方法論記事

Bacterial Co-Incubation Assay:単一細胞レベルでの種内細菌の競合を可視化するための蛍光顕微鏡ベースの技術

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Smith, S., et al., Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、単一細胞レベルでの細菌の競争を研究するための蛍光顕微鏡法に基づく方法を示しています。この方法は、細菌群集の構造と機能に関する洞察を提供します。

プロトコル

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1. 細菌株を共インキュベートします

  1. シングルセル細菌競合アッセイには2つの細菌株を選択してください。ここでは、標的株(ES11424)と、接触依存的な殺傷機構であるII染色体上のVI型分泌系(T6SS2)1を用いて標的株を死滅させることが知られている阻害剤株(MJ1125)の2株を用いています。
  2. さまざまな蛍光タンパク質(GFPやRFPなど)の遺伝子をコードする安定なプラスミドで株を形質転換し、顕微鏡で株の種類を視覚的に区別します。ここでは、阻害剤株にはGFPコードプラスミド(pVSV102)を、標的株にはdsRedコードプラスミド(pVSV208)をタグ付けします。
  3. 両方の菌株の中間対数培養から始めて、すべてのサンプルについて600 nm(OD600)での光学密度を測定し、記録します。
  4. 培養物をLBS培地で希釈することにより、各サンプルをOD600 = 1.0(V. fischeriの約109 CFU/mLに相当)に正規化します。
  5. 2つの競合する菌株を容量に基づいて1:1の比率で混合し、正規化された各菌株を30 μLを標識された1.5 mLチューブに加えます。混合株培養を1-2 s.
    でボルテックスします。 手記：場合によっては、異なる比率で共培養を混在させることが適切である場合があります。たとえば、一方の株が他の株よりもはるかに速く成長する場合、競争を観察するために、成長の遅い株を数値的に有利に開始する必要があるかもしれません。OD600が両方の菌株の同様のCFU/mLに対応しない場合にも、最適化が必要になることがあります。
  6. 生物学的複製と処理ごとにステップ1.5を繰り返します。ここに示す例では、合計4本の混合株チューブが生成されます:2つの生物学的複製は野生型阻害剤株と標的株と混合され、2つの生物学的複製は標的株と混合されたVI型分泌系変異株との生物学的複製です。
  7. 寒天パッド上の共インキュベーションで競合する細胞が接触依存性殺傷に十分な密度であることを確認するには、混合培養物を標準的な1.5 mL遠心チューブで21,130 x gで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、各ペレットを20 μL LBS培地に再懸濁することにより、各混合培養物を3倍に濃縮します。各サンプルに対して繰り返します.
    手記：一部の細菌細胞は、高rcfでの遠心分離による損傷に敏感です。このような場合、混合培養物を4600 x gで3分間遠心分離することができる。さらに、接触依存性の競争を定量化する場合、死滅を観察するためにスライド上の細胞密度を十分に確保することが重要です。本稿では、殺傷が観察される「混雑した」治療では、約10細胞/20μm2であった。

2. スライドのセットアップ

  1. 正立顕微鏡を使用する場合は、~5 mm2 のアガロースパッドを標準の 1 mm スライドガラスの上に置きます。混合培養物をアガロースパッドに2 μLスポットし、その上に#1.5カバースリップ(25 mm2)を貼ります。 図 1B を参照してください。
  2. 倒立顕微鏡を使用する場合は、35 mmシャーレの#1.5カバースリップ底部に混合培養物の2 μLをスポットし、共インキュベーションスポットに~5 mm2アガロースパッドを置きます。12mmの円形ガラスカバースリップをアガロースパッドの上に置きます。例については、図 1C を参照してください。
  3. 使用する顕微鏡のセットアップに応じて、残りの3つの混合培養物についてステップ2.1または2.2を繰り返し、4つのスライドまたはディッシュをイメージングします。
  4. スライドをベンチトップに約5分間置いてから、先に進みます。これにより、細胞は寒天パッドに定着し、イメージングプロセス中の動きを排除することができます。

3. 蛍光顕微鏡

  1. まず、白色光(位相差またはDIC)を使用して細胞に焦点を合わせ、光退色の影響を最小限に抑えます。1つの細菌細胞の平均サイズに基づいて、60倍または100倍のオイル対物レンズを使用します。
  2. 各チャンネルの露光時間と取得設定を調整して、細胞が最小限のバックグラウンド検出で適切なチャンネルに表示されるようにします.
    手記：チャンネルごとに異なる露光時間を使用することは適切ですが、特定のチャンネルのすべての生物学的複製と処理で同じ露光時間を使用する必要があります。
  3. 各サンプルについて、少なくとも5つの視野(FOV)を選択し、取得設定を使用して適切な各チャンネルで画像を取得します(図2の例を参照)。各 FOV の XY ポイントを保存して、最終時点に同じ FOV を画像化できるようにします。解析ステップ中に標的細胞または阻害剤細胞が占める面積の割合を決定するには、各時点で同じFOVをイメージングする必要があります
    手記：この例では、励起波長が467〜498 nmのフィルターと513〜556 nmの蛍光フィルターを使用してGFPの蛍光を検出し、偽色の緑色です。dsRedの蛍光は、励起波長542〜582 nmのフィルターと603〜678 nmの蛍光フィルターを使用して検出され、偽色のマゼンタです。
  4. 2時間後、以前に保存したXYポイントを使用して、各サンプルに対して上記の手順を繰り返します(図2).
    手記：後続の画像のタイミングは、異なる成長率または競合メカニズムを持つ生物に対して最適化する必要があるかもしれません。

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結果

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図1:コインキュベーションアッセイのためのアガロースパッド調製とスライドセットアップ。(A)2%アガロースパッドを作成するためのセットアップ。ラボ用テープ(緑色)を約20mm間隔でカバースリップに巻き付けます。次に、海洋性リン酸緩衝生理食塩水(黄色)中の温かい2%アガロースをテープ片の間にピペットで挟み、すぐに25 mm2のカバースリップで覆い、室温で少なくとも1時間固化させます。カミソリの刃を使用してアガロースパッドを~5mmの2ピースにカットし、ピンセットを使用してパッドを新しいスライドに移し、イメージングします。(B)正立顕微鏡でイメージングする場合は、5 mm2アガロースパッドをスライド上に直接置き、その後、混合培養(青)と12 mmの円形#1.5カバース...

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL マイクロ遠心チューブ漁夫05-408-129
10 uL シングルチャンネルピペット
1000 uL シングルチャンネルピペット
20 uL シングルチャンネルピペット
200 uL シングルチャンネルピペット
アガロース漁夫BP165-25低融点アガロース
セルビス35mmディッシュ漁夫NC0409658#1.5カバーガラス底
クロラムフェニコールシグマC0378ストック(エタノール中20 mg/mL)、培地中の最終濃度(2 μg /mL LBS)
フィジー画像解析ソフトウェアイメージJhttps://imagej.net/Fiji/Downloadsオープンソースソフトウェア
フィッシャーブランドカバーグラス:サークル漁夫12-545-81P#1.5カバーガラス、直径12mm
カナマイシン硫酸塩漁夫BP906-5ストック(水溶液100 mg/mL、フィルター滅菌)、培地最終濃度(1 μg/mL LBS)
レンズクリーニングティッシュペーパー漁夫S24530
ペトリプレート漁夫FB0875713蓋付き滅菌
カミソリブレード漁夫S65921
セミマイクロキュベットVWRの97000-586
分光 光度 計
Thermo Scientific Gold Seal プレーン顕微鏡スライド漁夫12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientificカバーガラス漁夫22-050-235#1.5カバーガラス、25 mm2
タイプF浸漬油漁夫NC0297589
カメラとイメージングソフトウェアを備えた直立または倒立蛍光顕微鏡この記事の画像は、NIS-Elementsソフトウェアを使用して、ORCA-Fusion Digital CMOSカメラを搭載したNikon TI-2倒立蛍光顕微鏡で取得しました。
渦動
ウォーターバスピペッティング前にアガロースを保温するために使用
LBSメディア
1M トリスバッファー (pH ~7.5)50 mL 1 M ストックバッファー (HCl 62 mL、DI 水 938 mL、Trizma 塩基 121 g)
寒天テクニカル漁夫DF0812-17-915g(プレートのみ追加)
DI水950ミリリットル
塩化ナトリウム漁夫S640-320グラム
トリプトン漁夫BP9726510グラム
酵母エキス漁夫BP9727-25グラム
mPBS(マリンPBS)リン酸塩緩衝生理食塩水に海塩を加えたもの、アガロースパッドの製造に使用
PBSの10倍漁夫ICN1960454
インスタントオーシャンシーソルトインスタントオーシャンSS1-160P濃度を適切な塩分濃度に調整します。ここでは 20 psu を使用します
滅菌真空フィルターユニット漁夫SCGVU01REmPBSのフィルター滅菌に使用
真空ポンプmPBSのフィルター滅菌に使用

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