Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay:タンパク質間相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのビーズベースの近接アッセイ

要約

出典: Wang, L. et al., Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、ビーズベースの近接アッセイである増幅発光近接均質アッセイを実演します。これは、均質なサイズのアクセプタービーズとドナービーズを利用し、相互作用する傾向がある2つのタンパク質で固定化され、タンパク質相互作用を阻害する可能性のある小分子をスクリーニングします。

プロトコル

>注:このプロトコルの概要を図1に示します。

1. GST-FKBP51およびGST-FKBP52の発現と精製(図1A)

1. プラスミド
   注:ヒトFKBP51(クローンID:5723416)およびヒトFKBP52(クローンID:7474554)のcDNAクローンをIMAGEコンソーシアムから入手してください。
   1. BamHIおよびXhoIオーバーハングを含むプライマー(forward; 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3', reverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3')を用いてPCRによりヒトFKBP51 DNAを増幅し、BamHI / XhoI制限部位でpGEX6-1ベクターにクローニングします。
   2. EcoRIおよびXhoIオーバーハングを含むプライマー(フォワード;5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3'、リバース;5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3')を用いてPCRによりヒトFKBP52 DNAを増幅し、EcoRI/XhoI制限部位でpGEX6-2ベクターにクローニングします
      手記：PCR反応のセットアップと条件を表1と表2に示します。
   3. 挿入された配列を確認し、製造プロトコルに従ってプラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌に形質転換します。
2. タンパク質の発現と精製
   1. 蒸留水1Lに25gのルリアブロス(LB)ベースを加えてLB溶液を作ります。121°Cで15分間オートクレーブします。冷却後、50 μg/mL のアンピシリンを添加します。
   2. GST-FKBP51またはGST-FKBP52を発現する細菌のコロニーを取り、1.5 mLチューブに500 μLのLB溶液と混合します。渦動。
   3. アルミホイルで覆われた三角フラスコのLB溶液1Lに「1.2.2」の混合物を加えます。.三角フラスコをシェーカーで37°Cで一晩インキュベートします。
   4. 1 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を三角フラスコに添加してタンパク質発現を誘導し、さらに2時間インキュベーションを続けます。
   5. 細胞ペレットを得るには、5,000 x gで15分間遠心分離し、上清を取り除きます
      手記：セルペレットは-20°Cで保存できます。
   6. 細胞ペレットを40 mLのPBSに再懸濁し、氷上で3 x 20 sを超音波処理します。1 mM PMSF、1 mM EDTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(1錠)を添加して、タンパク質分解を予防します。
   7. 懸濁液を50,000 x gで30分間遠心分離して細胞破片を除去し、上清を5 mL GSTトラップカラムに塗布します。
   8. カラムを 30 mL PBS で洗浄した後、GST-FKBP51 および GST-FKBP52 を PBS 中の 10 mM グルタチオン 5 mL で溶出します。
   9. 15 mL 10.000 MWCO遠心分離ユニットでタンパク質を濃縮します。遊離グルタチオンを除去するには、0.5x PBSで平衡化したPD-10カラムに濃縮物を通し、再びフィルター遠心分離機に濃縮します。
   10. タンパク質含有画分を採取します。SDS-PAGEでタンパク質を確認し、タンパク質濃度を1 mg/mL.
       に調整します。 手記：典型的なタンパク質収量は2〜5 mg / Lの培養です。タンパク質は-20°Cで保存できます。

2. Hsp90 C末端ペプチドのアクセプタービーズへの結合(図1B)

1. Hsp90ペプチド調製
   1. ヒトHsp90βアイソフォーム(UniProt ID:P08238)のアミノ酸714-724に対応する10種類のアミノ酸ペプチドNH 2-EDASRMEEVD-COOHをペプチド合成サービスにより合成します。
   2. Hsp90ペプチドをPBSで1 mg/mLの濃度に希釈します。
2. アクセプタービーズの準備
   1. 非標識アクセプタービーズをPBSで1 mg/mLの濃度に希釈し、1.5 mLチューブに移します。
   2. 16,000 x gで15分間遠心分離して洗浄し、上清を慎重に取り除きます。
3. 活用
   1. ビーズとペプチドの比率を10:1に設定します。アクセプタービーズペレット1mg(上記のように調製)を含む1.5mLチューブに、PBS(pH 7.4)1mL、希釈ペプチド0.1mg、Tween-201.25μL、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(_NaBH3CN)の400mM溶液10μLを水に添加する
      注意：NaBH₃CNは有毒です。ドラフトと手袋を使用してください。NaBH₃CN溶液は新たに調製する必要があります。
   2. ロータリーシェーカーでエンドオーバーエンド攪拌(10-20 rpm)を行いながら、37°Cで24時間インキュベートします。
4. 反応焼入れとビーズ洗浄
   1. 1 M Tris-HCl(pH 8.0)溶液20 μLを反応液に添加し、未反応部位をブロックします。37°Cで1時間インキュベートします。
   2. 16,000 x g(または最高速度)で4°Cで15分間遠心分離し、上清を除去し、ビーズペレットを1 mLのTris-HCl溶液(100 mM、pH 8.0)に再懸濁します。
   3. 洗濯手順を3回繰り返します。
   4. 最後の遠心分離後、保存バッファー(0.01%アジ化ナトリウムを保存剤として含有させた0.5 × PBS1 mL)にビーズを1 mg/mLで再懸濁します。コンジュゲートアクセプタービーズ溶液を4°Cで保存します。
      注意：アジ化ナトリウムは有毒です。ドラフトと手袋を使用してください。

3. GST-FKBP51またはGST-FKBP52とHsp90 C末端ペプチドとの相互作用、および低分子量化合物による阻害を調査するアッセイ(図1C)

1. グルタチオンドナービーズと相互作用するGSTタグタンパク質
   1. 反応液を384ウェルプレートにセットします。
   2. 0.5x PBS、pH 7.4.
      に 10 μg/mL のグルタチオン供与体ビーズを含む溶液を調製します。 手記：長期間保管すると、ビーズは落ち着き、ボルテックスする必要があります。
   3. GST-FKBP51またはGST-FKBP52を最終濃度10 μg/mLまで添加します。
   4. 暗所25°Cで10分間インキュベート
      手記：このステップでは、GSTタグ付きタンパク質がビーズに付着したグルタチオンと相互作用します。各ウェルについて、この混合物の22.5μLが使用されます。結合パートナーの濃度は、経験的に決定する必要があります。GST-FKBP51 と GST-FKBP52 を滴定し、最適なシグナルが得られる濃度を選択します。
2. 化合物の添加
   1. DMSO.
      で試験化合物の段階希釈を行います 手記：使用される濃度は通常、10、30、100、300、1,000、および3,000μMです。
   2. 0.25 μLのDMSO(ネガティブコントロール)またはHsp90 C末端ペプチド(ポジティブコントロール、30 μM)、またはDMSO中の化合物をプレートの各ウェルの角に添加します。化合物濃度ごとにトリプリケートを使用してください。
   3. GSTタグ付きタンパク質を含むグルタチオンドナービーズを含む溶液22.5 μLを各ウェルに加えます。
   4. プレートを手で優しく、しかしよく振ってください。暗所25°Cで15分間インキュベートします.
      手記：この間、化合物はHsp90 C末端ペプチド結合部位のTPRドメインと相互作用します。
3. アクセプタービーズ添加
   1. Hsp90 C末端ペプチドを付着させたアクセプタービーズを0.5x PBSで100 μg/mLに希釈します。
   2. 希釈したアクセプタービーズ2.25 μLを各ウェルに加えます。
   3. やさしく、しかしよく混ぜます。暗所25°Cで15分間インキュベートします.
      手記：このステップでは、ドナービーズとアクセプタービーズがタンパク質-ペプチド相互作用によって近接します。反応混合物の最終容量は25μLです。したがって、化合物の最終濃度は0.1〜30μMの範囲です。
4. プレート読み取り
   手記：該当モードに設定されたプレートリーダーを使用してプレートを読み取ります。
   1. 機器の電源を入れ、ソフトウェアを開きます
   2. 関連するプロトコルを選択します。
   3. 「プレートマップの編集」をクリックし、プレートで測定に使用されているウェルを選択します。
   4. 「次へ」をクリックして続行し、選択したプロトコルを実行します。
   5. 測定後、「Show Results」をクリックして結果を表示します。
   6. データをエクスポートします。

表1:ヒトFKBP51およびFKBP52 DNA増幅用に設定されたPCR反応。

名

反応成分	容量 (μL)
PCRバッファー(5 x concentrate)	4
フォワードプライマー	1
リバースプライマー	1
プラスミド	0.5
dNTPミックス(各10 mM)	0.5
Phusion DNAポリメラーゼ	0.5
水(DNAグレード)	12.5
トータル	20

>表2:ヒトFKBP51およびFKBP52 DNA増幅のサーモサイラー条件。

名 名 名 名 名

舞台	温度 (°C)	時間	サイクル
初期変性	94	3分間	1
変性	94	30秒	35
アニーリング	56	30秒
延長	72	1分間
最終的な延長	72	5分間	1
注:蓋の温度は105°Cです。

結果

図1:このプロトコルの概略図。(A)GST-FKBP51およびGST-FKBP52の発現および精製。(B)Hsp90 C末端ペプチドのアクセプタービーズへのカップリング。(C)GST-FKBP51またはGST-FKBP52とHsp90 C末端ペプチドとの間の相互作用を調査するアッセイ。低分子量化合物による阻害。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
384ウェルプレート	パーキン・エルマー	6008350	アッセイ量 25 ml
Amicon 10.000 MWCO遠心分離ユニット	ミリポア	UFC901008	濃縮タンパク質
アンピシリン	シグマ	A0166	抗生物質
バクテリアシェーカー Unimax 1010	ハイドルフ		培養細菌
ヒトFKBP51のcDNAクローン	出典:BioScience	クローンID:5723416	pCMV-SPORT6ベクトル
ヒトFKBP52のcDNAクローン	出典:BioScience	クローンID:7474554	pCMV-SPORT6ベクトル
ケミカルコンピテント大腸菌	インビトゲン	C602003	ワンショット BL21 スター (DE3)
DMSOの	スペルコ	1.02952.1000	希薄な化合物
DPBSの	ギブコ	14190-144	溶液を準備する
EDTAの	カルバイオケム	344504	超音波処理中のタンパク質分解を防ぐ
グルタチオン	シグマ	G-4251	GSTタグ付きタンパク質の溶出
グルタチオンドナービーズ	パーキン・エルマー	6765300	ドナービーズ
GSTトラップカラム	サイティバ(GEヘルスケア)	17528201	GSTタグ付きタンパク質の精製
イソプロピル-β-D-チオガラクトシド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R0392	タンパク質発現の誘導
LBブロス(ミラー)	シグマ	L3522	微生物増殖培地
PCR機器	バイオラッド	S1000サーマルサイクラー	増幅/PCR
PD-10カラム	サイティバ(GEヘルスケア)	17085101	ソリューション交換
pGEX-6P-1ベクトル	サイティバ(GEヘルスケア)	28954648	プラスミド
pGEX-6P-2ベクトル	サイティバ(GEヘルスケア)	28954650	プラスミド
プレートリーダー	パーキン・エルマー	EnSpire 2300 マルチラベルリーダー	アルファプレートの読み取り
プレートリーダーソフトウェア	パーキン・エルマー	エンスパイア・マネージャー	プレートリーダーソフトウェア
プレートリーダーソフトウェアプロトコル	パーキン・エルマー	Alpha 384ウェル 少量	このプロトコルを使用してプレートを読み取ります
PMSFの	シグマ	P7626	超音波処理中のタンパク質分解を防ぐ
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ	S8830	超音波処理中のタンパク質分解を防ぐ
アジ化ナトリウム	シグマ	S2002	防腐剤として
シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)	シグマ	156159	カップリングのマトリックスをアクティブ化します
ヒトHsp90ベータアイソフォームのアミノ酸714-724に対応する10個のアミノ酸ペプチドNH2-EDASRMEEVD-COOH	ペプチド2.0株式会社		Hsp90 C末端ペプチドの合成
試験管ローテーター	ラビンコ		エンド・オーバー・エンドの攪拌を行う
トリス-HCl	シグマ	10708976001	アクセプタービーズの未反応部位をブロック
Tween-20 (トゥイーン 20	シグマ	P1379	ビーズの凝集を防ぐ
超遠心分離機 Avanti J-20 XP	ベックマン・コールター		遠心分離機でバクテリア細胞ペレットを採取
超音波細胞かく乱物質	ミクロソン		細胞を超音波処理してタンパク質を放出します
非標識アクセプタービーズ	パーキン・エルマー	6762003	アクセプタービーズ
XCell SureLock ミニセルおよび XCell II ブロットモジュール	インビトゲン	EI0002	SDSページ

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