ウイルスプラークアッセイ:ウイルス感染細胞の単層に形成されたプラークの定量化により感染性単純ヘルペスウイルスを測定する技術

要約

出典:Sadowski, L. A. et al.単純ヘルペスウイルスのプラーク。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、感染性単純ヘルペスウイルスまたはHSVのウイルスプラークアッセイについて説明しています。希釈されたウイルス粒子は、上皮細胞の単層に接種されます。インキュベーションすると、ウイルスはプラークを形成し、感染性ウイルスの力価を決定するために視覚的にカウントされます。

プロトコル

1. Vero細胞の播種

1. プラークアッセイを開始する前日に、Vero細胞をトリプシン化し、通常のダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)に再懸濁し、標準的な細胞培養方法に従って補充します。トリプシン処理した細胞を、コンフルエントなVero細胞(~10⁷細胞)のT-75フラスコあたり10 mLのDMEMに再懸濁します
   注:DMEMは、細胞増殖速度をわずかに遅くし、より良いプラークアッセイ結果を好むため、α-MEMの代わりにプラークアッセイに使用されます。
2. お好みの方法(例:トリパンブルー排除の標準的な血球計算盤)で細胞をカウントします。
3. 4 x 10⁶細胞/プレートで細胞を播種します。HSV-2 の場合は、ウェルあたり 2.5 mL の DMEM (サプリメントを含む) を含む 6 ウェルプレートを使用します。HSV-1 の場合は、ウェルあたり 1.25 mL の DMEM を含む 12 ウェルプレートを使用します。
   注:細胞の数は、使用するプレートに関係なく一定である必要がありますが、ウェルのサイズはプラークアッセイの精度に関係します。細胞を均等に分散させることが不可欠であり、これはプレートを円形ではなく前後に動かすことによって最も効果的に達成できます。
4. 加湿インキュベーターで細胞を37°C/5%_CO2で一晩増殖させます.
   注:湿度は、インキュベーターの底に殺藻剤を含む蒸留水の鍋で維持されます。

2. サンプル希釈

1. サンプルの希釈とウイルスの細胞への添加を1回のラボセッションで完了します
   注意:HSV-1および-2はヒトに感染性があるため、適切なバイオセーフティ封じ込め(BSL-2)の下で取り扱わなければなりません。ウイルスと接触するすべての材料を分離し、1/256希釈の第四次薬剤(材料表を参照)、ヨードフォア、漂白剤、または強イオン性洗剤(SDSなど)で消毒してから、バイオセーフティキャビネットから取り出してください。
2. Vero細胞の播種翌日に、プラーク状にする各ウイルスサンプルを1x PBSで連続希釈します。通常、最も正確な追跡のために10倍希釈を使用します。
3. これらの希釈を^10-4(低濃度のウイルスの場合)または^10-9(高力価のサンプルが予想される場合)で行い、各サンプルの少なくとも1 mLをプラークアッセイ自体に残します。
4. これらの希釈したウイルスサンプルを細胞に加える準備ができるまで、すべてのウイルス希釈液を氷上(1時間以内)に保管します。

3. 細胞へのウイルスの添加

1. ピペットで1つまたは2つのウェルから細胞培養培地を取り出します.
   注:吸引器は、細胞単層から液体を過剰に除去し、細胞を乾燥させるため、使用しないでください。重要な考慮事項の1つは、実験の全過程を通じて細胞単層が水和されたままであることを確認することです。細胞が乾燥すると、最終ステップでプレートが洗い流され、使用できないデータが生成されます。したがって、この可能性を減らすために、一度に1つまたは2つのウェルのみを処理します。
2. 希釈したウイルスサンプル(6ウェルプレートと12ウェルプレートにはそれぞれ100〜400μLと50〜200μLのウイルスサンプルを使用)を各単層に慎重に加え、各ウェルの側面に滴を追加します。プレート全体がプラーク処理されるウイルスサンプルで満たされるまで、1つまたは2つのウェルごとにこのプロセスを繰り返します.
   注:ウェルの中央に液滴を追加すると、誤って細胞が基質から剥がれ
落ちる可能性があります。
3. プレート全体を手で静かに揺らして、ウイルスを含むPBSが各ウェルの細胞の単層全体を覆っていることを確認してから、プレートを37°Cの_CO2インキュベーターに入れてウイルスを吸着させます。
4. 1時間以内に10分ごとにプレートをインキュベーターから取り出し、再び穏やかに振ってウイルスを各ウェルに均一に広げてから、インキュベーターに戻します
   注:各実験では、反復回数と使用する希釈液を決定します。読者の好みがその決定を決定します。
5. 誤って未吸収の接種物をカウントする可能性を減らすために、1000μLのピペットチップでウイルスサンプルをウェルから取り出し、廃棄物ビーカーに入れます
   注:繰り返しになりますが、この手順は、細胞単分子膜の水和を維持するために、一度に1つまたは2つのウェルのみで実行されます。
6. 2.5 mLのメチルセルロースオーバーレイを置きます(5%メチルセルロースw / wを100 mLのPBSに溶解し、121°Cおよび15 psiで15分間オートクレーブし、液体サイクルで15分間オートクレーブし、375 mLのDMEMと25 mLのFBSを加えます)。
7. プレート全体にオーバーレイが含まれたら、プレートをインキュベーターに戻し、2日間成長させます
   注:ウイルスと細胞を3日間増殖させると、DMEMとサプリメントを併用しても、単層の細胞が大幅に失われ、最終データが損なわれる可能性があります。
8. 廃棄物ビーカーをバイオセーフティキャビネットから取り外す前に、通常は漂白剤、ヨードフォア、または同様の殺ウイルス剤を追加して
消毒します。

4. プラークの染色

1. 2日間のインキュベーション後、ピペットでメチルセルロースオーバーレイを一度に1つまたは2つのウェルで取り除き、廃棄物ビーカーに入れます。
2. 50%エタノール中の1%クリスタルバイオレット(材料表を参照)を~2 mL各ウェルに加え、プラークを染色します
   注意: オーバーレイの最後の一滴まで削除する必要はありません。
3. すべてのウェルに染色物を充填した状態でプレートを37°Cで30分間インキュベートします。この時点で、上記の手順3.8のように廃棄物ビーカーを消毒します。
4. 流出が明確になるまで水道水でプレートを激しく洗います.
   注:穏やかな水の流れは十分に活発ではありません。ラボシンクフィクスチャからの完全な圧力が必要です。
5. この時点で、各希釈シリーズ全体でプラークの数に約10倍の差があることを確認してください。
6. プレートを逆さまにして一晩乾かし、その後、個々のプラークを数えることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	コーニング	3512
6ウェルプレート	コーニング	3516
アルファ-MEM	ロンザ	12169ファックス
抗生物質/抗真菌薬	ギブコ	15240096
クリスタルバイオレット	アルファ・アエサル	B2193214
DMEM	ギブコ	11965092
ダルベッコのPBS(Mg ++またはCa++なし)	ギブコ	14190144
ウシ胎児血清	ミリポアシグマ	TMS-013-B
L-アラニル-L-グルタミン(グルタマックス)	ギブコ	GS07F161BA
血球計算盤	サーモフィッシャー	02-671-54
メチルセルロース	ミリポアシグマ	27-441-0
第四級薬剤(ライゾールI.C.)	サーモフィッシャー	NC9645698
トリパンブルー	コーニング	25900CI
トリプシン	サイティバ	01 SH30042月
ベロ細胞	ATCCの	CCL-81

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