Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling—TUNEL Assay: アポトーシス細胞におけるDNA断片化を検出するためのIn Situ法

要約

出典:Brannelly, L. A., et al. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、サンプル中のアポトーシス細胞の存在を検出するためにTUNELアッセイを行っています。この研究では、特殊なDNAポリメラーゼ(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)を使用して、断片化されたDNAの3'末端に標識されたdUTPの付加を触媒し、蛍光顕微鏡で観察および同定できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. チューネルアッセイ

1. ツボカビ症の臨床徴候を示している動物と同数のBd陰性対照動物を安楽死させます。
2. 各動物の皮膚(背側、腹側、大腿部)のサンプルを解剖します。皮膚サンプルを4%v/vリン酸緩衝ホルムアルデヒド中で2時間固定します。固定時間が短く、一貫したため、組織を完全に固定できるだけでなく、効果的かつ正確な免疫組織化学染色も可能になります。その後、切片化のために埋め込むまで80%エタノールに移します。
3. 標準的な方法に従って組織学的調製のためにパラフィンワックスに皮膚を埋め込みます。簡単に言うと、プロトコルは次のとおりです。
   1. 段階的な一連のエタノールで組織を脱水し、キシレンでエタノールを除去します。組織をパラフィンワックスに埋め込み、各個体の3つの皮膚サンプルすべてを1つのパラフィンブロックに配置します。
4. 標準的な組織学的調製後のミクロトームを使用した皮膚切片。組織を5μmで連続切片にし、親水性スライドガラスに貼り付けます。スライドごとに皮膚タイプごとに4つの連続組織切片を配置します。シリアルスキンセクションを持つ個々の3つのスライドを作成し、各スライドには各組織の4つのセクションが貼り付けられていることを忘れないでください。
5. スライドを次の順序で染色します。
   1. 最初のスライドをヘマトキシリンで染色し、続いてエオシン対比染色(H&E)で染色します。このスライドは、皮膚内のBd胞子嚢の位置を視覚化するためのものです。
   2. 組織学的調製のために市販のTUNELアッセイに従って2枚目のスライドを染色し、以下に説明する製造元の指示に従ってください。
      1. まず、スライドをキシレンの3回交換で5分間洗浄することにより、コプリンジャー内の組織切片を脱パラフィンし、続いて100%エタノールを2回交換して5分間洗浄します。続いて、95%エタノールを3分間、次に70%エタノールを3分間1回洗浄します。PBSを1回5分間洗浄して終了します。
      2. 希釈したばかりのタンパク質消化酵素(PBSで希釈した濃度20 μg/mLのプロテイナーゼK)で組織を前処理し、スライドに直接添加します。15分間インキュベートします。PBSを2回交換して、コプリンジャーでそれぞれ2分間洗浄します。
      3. 余分な液体を軽くたたいて、室温で2分間、コプリンジャー内のPBS中の3.0%過酸化水素で急冷します。
      4. 余分な液体を軽くたたいて取り除き、75 μL/5 cm²の平衡緩衝液をスライド上の組織に直接塗布します。10秒間インキュベートします。切片の周りの余分な液体を軽くたたいて、55 μL/5 cm²の作用末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)酵素を塗布します。加湿チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。
      5. TdTインキュベーション後、スライドを作動強度停止/洗浄バッファーのコプリンジャーに入れ、15秒間撹拌し、室温で10分間インキュベートします。PBSを3回交換してスライドを1回の洗浄につき1分間洗浄します。余分な液体を軽くたたいて落とします。
      6. 室温に温めた抗ジゴキシゲニン抱合体(ロダミン)を組織(65μL / 5 cm²)に塗布します。加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートし、光に触れないようにしてください。PBSを4回交換して、1回の洗濯につき2分間洗ってください。余分な液体を軽くたたいて落とします。
      7. スライド埋込培地中の0.5 - 1 μg/mL DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)15 μLをスライドに添加して仕上げます。これは対比染色として機能します。次に、カバースリップで覆い、マニキュアまたはゴムセメントで密封します。アッセイは光に敏感であるため、スライドを暗闇で乾燥させます。
   3. TUNELアッセイとDAPIカウンターステインを使用して3枚目のスライドを染色しますが、各サンプルのポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用します。
      注:コントロールスライドの4つの組織切片のうち、最初の2つはポジティブコントロールの複製であり、最後の2つはネガティブコントロールの複製です。
      1. ポジティブコントロールの場合、ステップ1.5.2.2の代わりに、DNバッファー(30 mM trizma base、pH 7.2、4 mM MgCl₂、0.1 mM DDT)で組織を前処理し、室温で5分間インキュベートします。次に、Dnase IをDNバッファーに溶解して最終濃度0.1ug/mLにし、スライドに直接適用します。室温で15分間インキュベートします。その後、スライドをdH₂Oを5回洗浄して各洗浄で3分間洗浄します。余分な液体を拭き取ります。次に、セクション1.5.2.3の指示に従ってTUNELアッセイを再開します。
      2. ネガティブコントロールの場合、末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)酵素をこれらのサンプルに追加しないでください(セクション1.5.2.4で説明)。

2. アッセイ終了後すぐにTUNELスライドを観察します。

1. 蛍光顕微鏡を使用して、アポトーシス細胞が現れて赤く見えるローダミン染色と、すべての核が現れて青色に見えるDAPIの両方のフィルターを使用して、各皮膚部分に沿ってランダムな間隔で写真を撮ります。サンプルごとに皮膚切片ごとに少なくとも100個の細胞が撮影されていることを確認してください。スライドは、-20°Cの暗い顕微鏡ボックスに保管します。
2. 画像ごとに細胞(青色DAPI染色)をカウントします。皮膚切片ごとに少なくとも100個の細胞がカウントされていることを確認してください。100 個のセルに達するには、画像内のすべてのセルをカウントします。1つの画像に100個未満の細胞が存在する場合は、動物ごとに皮膚切片ごとに少なくとも100個の細胞に達するまで、別の画像をカウントします。
3. 次に、同じ画像(赤色ローダミン染色)中のTUNEL陽性細胞の数をカウントします。壊死やバックグラウンドではなくアポトーシスを示すTUNEL陽性細胞は、細胞のエッジが明瞭な単一細胞です(膜は無傷で溶解はありません)。細胞が収縮してアポトーシス体を形成することがあります。
4. TUNELアッセイでカウントされた領域を特定し、H&E染色組織切片の対応する領域を分析します。H&E染色切片がBd感染部位に対応していることを確認できるため、TUNELアッセイでアポトーシス細胞をカウントする際にBd感染部位が使用されることが保証されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポーラースターオメガ	BMGラボテック		発光プレートリーダー
384ウェルフラットクリア底板	コーニング	3707
384ウェルローフランジホワイトフラットボトムプレート	コーニング	3570
Formal-Fixx 10% 中性緩衝ホルマリン	漁夫	6764254
ApopTag Red In Situ アポトーシス検出キット	メルクミリポア	S7165
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、pH 7.2(1X)	サーモ/ライフ	20-012-043
パラフィルム	ビーミス	PM996
エタノール、200プルーフ、分子グレード	漁夫	BP2818500
ZEISS Axio Scan蛍光ミスクロスコープ	カールツァイス		蛍光顕微鏡
細胞培養用ペトリプレート	ヌンク	263991

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