Caspase-3/7 Assay:カエルの皮膚外植片におけるCaspase-3/7活性を測定することによりアポトーシスを定量化する発光ベースのアッセイ

要約

出典:Brannelly, L. A. et al., Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、細胞死またはアポトーシスを定量するためのin vitro Caspase-3/7発光アッセイについて説明しています。このアッセイは、プロ発光DEVD基質のカスパーゼ-3/7切断後に生成される発光を測定します。生成される発光は、カスパーゼ-3/7の活性に比例します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 畜産と監視

1. 動物を個別に飼育し、種に適した環境で、適切な水、給餌、清掃のスケジュールを立てます。動物を毎日チェックしてください。
   1. 絶滅の危機に瀕しているLitoria verreauxii alpina(カスパーゼ3/7アッセイ用、セクション4)の成体個体を使用し、飼育下の繁殖施設から寄贈されました。動物を15〜18°Cに維持し、苔と砂利の基質の上で、逆浸透水で毎日霧吹きし、腸を充填したコオロギを週に3回与えます。
2. 週に一度、各個人のデータを収集します。ステップ2.1で説明されているように、Bdの個々のスワブします。目盛りを使用して各動物の体重を0.1 g近くまで測定し、ダイヤルキャリパーを使用して鼻から通気口(SVL)までの長さを0.01 mm単位で測定します。
3. 接種後(セクション3に記載)、動物倫理ガイドラインを遵守して、感染の臨床徴候(皮膚の不規則な脱落、食欲不振、脚の発赤、嗜眠、または矯正反射の遅延)がないか動物を毎日チェックしてください。臨床徴候と罹患率が存在する場合は、動物を安楽死させます。
   1. トリカインメタンスルホン酸(MS222)の過剰投与で安楽死させます(0.1%w / v MS222をpH 6〜7に、老朽化した水道水中の重炭酸ナトリウムで)。動物をMS222に10分間置いておくと、すべての動きが止まり、刺激に対する反応が見られなくなります。

2. Bd感染の検査

1. BDのスワブ
   1. 新しい滅菌レーヨンスワブ(動物ごとに1つのスワブ)で各動物を綿棒します。次のスワブ方法を使用します:ベンターに5回、大腿部、側面、手足に5回。これは合計 45 ストロークです。
   2. 脳卒中中および脳卒中の間に綿棒を静かに回転させて、DNAを効果的に捕捉します。綿棒の先端を1.5 mLの微量遠心チューブに折り、抽出するまで-20°Cで保存します。
2. DNA抽出およびqPCRアッセイ
   1. スワブからゲノムDNAを抽出し、市販のDNA抽出試薬50μLと0.5mmシリカビーズ30〜40mgを添加します。ビーズビーター細胞攪乱器でサンプルを最高速度で2分間ビードビートしました。ビーズビーターステップに続いて、サンプルを2,000 x gで1分間遠心分離します。
   2. サンプルを100°Cで10分間インキュベートし、冷まします。サンプルを5,000 x gで3分間遠心分離し、上清を個々の1.5 mL微量遠心チューブに移し、qPCRまで-20°Cで保存します。
   3. Boyle et al. 2004 に続いて定量的 PCR (qPCR) を使用して、感染負荷を分析します。次の変更を使用します。
      1. DNA抽出サンプルを二重脱イオン水で6:100に希釈します。0.7 μLのウシ血清アルブミン(BSA)を各ウェルに添加して、PCR阻害を防止します。各サンプルを単数で実行します。各プレートで、ネガティブ(テンプレートなし)コントロールと一連の希釈標準によるポジティブコントロールを使用して、遊走子(感染)負荷を推定します。

3. 予防接種

1. カルチャーBd
   1. 1 Lの脱イオン水に16 gのトリプトン、2 gのゼラチン加水分解物、および4 gのラクトース(TGHL)を加えて培養ブロスを調製します。オートクレーブ(121°Cで40分間)し、ブロスを冷まします。
   2. Bd分離物(この場合、ニューサウスウェールズ分離株AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1、Passage number 11から単離)をTGHLブロスに接種し、23°Cで7日間増殖させた後、ブロス培養物をTGHL寒天プレートに移します。
   3. プレートを作るには、16 gのトリプトン、2 gのゼラチン加水分解物、4 gのラクトース(TGHL)、および10 gの細菌寒天を1 Lの脱イオン水とオートクレーブ(121°Cで40分間)に加えます。混合物が触れるほど十分に冷えたら、固まる前に、TGHL寒天を直径92mmの培養プレートに注ぎ、クラスIIの生物学的安全キャビネットで1/4から1/3が満たされ
   るようにします。
   4. 寒天が固まり、完全に冷えたら、液体ブロスから各プレートに0.5mLのBdを接種し、均等に広げます。Bdブロス混合物をプレート上で約1時間乾燥させてから、プラスチックパラフィンフィルムでプレートを密封します。プレートを寒天下にして23°Cで5〜7dインキュベートします。
2. 遊走子接種液用フラッドプレート
   1. 接種前に倒立光学顕微鏡で遊走子の運動性をチェックし、生存率を毎日確認します。遊走子の放出が多く、多くの遊走子が胞子嚢の外を泳いでいるとき、培養物は接種の準備が整います。
   2. 各プレートに3mLの老朽化した水道水または人工池の水を注ぎ、プレートに水を注ぎ、室温で10分間インキュベートして、遊走子が水中に放出されるようにします。潜伏期間後、遊走子懸濁液を新しい滅菌容器にデカントします。
   3. 血球計算盤を使用して、製造元の指示に従って遊走子濃度を推定します。遊走子懸濁液の濃度がわかったら、懸濁液を3mLあたり1 x 10⁶遊走子の濃度に希釈し、熟成した水道水で
   満たします。
3. 動物に接種する
   1. 各動物に接種するには、3 mLの接種混合物を個々の50 mL容器のベンターに注ぎます。.余分な接種物が接種容器の底に集まるのを待ちます。感染を確実にするために、各動物を個別の接種容器に24時間放置し、24時間の接種後、各個体を消毒したテラリウムに戻します。
      1. 13%の容量/容量(v / v)の市販の漂白剤溶液を使用してテラリアを消毒し、水で少なくとも2回すすぎ、24時間以上乾燥させます。
   2. Bd陰性対照の場合、3.2〜3.3と同じ方法を使用して動物に模擬接種を行いますが、Bd接種された寒天プレートの代わりに5mLの老朽化した水道水をBdフリーの寒天プレートで浸します。

4. カスパーゼ3/7アッセイ

1. 接種後 3 週目までは週に 1 回、実験終了までは隔週で、各動物 (Bd-曝露と Bd-陰性の両方) からつま先先を 1 人あたり最大 8 本収集します。
   1. 火炎滅菌ハサミで2番目の指骨の先端を切断し、1.5mLのマイクロチューブに入れ、-80°Cですぐに凍結します。
2. 凍結した足指サンプルからタンパク質を抽出します。
   1. 1.5 mLスクリューキャップマイクロチューブに2つのステンレススチールビーズ(3.2 mm)を入れた100 μLのサンプルバッファー(25 mM HEPES pH 7、5 mM MgCl₂)にサンプルを入れます。1分間のビーズを最高速度で叩き(ステップ1.2.1で使用したのと同じビーズビーターで)、続いて氷上で3分間の4サイクルでサンプルを溶解します。溶解後、サンプルを12,000 x g、4°Cで5分間遠心分離します。アッセイで使用する上清を採取します。
3. Bradfordアッセイを使用して、サンプルあたりのタンパク質濃度を定量します。
   1. 384ウェルプレートで、10 μLのタンパク質抽出物と10 μLのBradford試薬を混合し、室温で2分間インキュベートします。各サンプルを、一連の5倍BSA希釈標準試料とともに、二重に実行します。吸光度プレートリーダーで595nmの吸光度を読み取ります。
4. あるいは、つま先のサンプルが小さすぎる場合(タンパク質濃度がBradfordアッセイから決定された最低標準に近い場合、またはサンプリングされたカエルの総重量が3 g未満の場合)、Bradfordアッセイではなく、写真を使用して皮膚表面積を推定することにより、サンプルを標準化します。
   1. カスパーゼアッセイのためにサンプルからタンパク質を抽出する前に、倒立型光学顕微鏡を使用して各つま先を40倍の倍率で撮影します。
   2. コンピュータイメージングソフトウェアを使用して、つま先の面積を推定することにより、つま先サンプルを分析します。これを行うには、つま先クリップの端の周りに線を引き、イメージングソフトウェアに形状内の領域を推定させます。次に、その面積にπ(3.14)を掛けると、3次元皮膚サンプルの表面積が近似されます(長さx断面積(π×直径)がチューブの外表面積を与えるため)。
5. カスパーゼ3/7アッセイを実施します。
   1. 384ウェル発光プレートに、市販のカスパーゼ3/7試薬10 μLとタンパク質抽出物10 μLを添加します。各サンプルを 3 回に分けて実行します。
   2. プレートを15秒間ゆっくりと振とうして試薬を混合し、プレートを室温で30分間光から離してインキュベートします。発光プレートリーダーを使用して発光を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポーラースターオメガ	BMGラボテック		発光プレートリーダー
384ウェルフラットクリア底板	コーニング	3707
384ウェルローフランジホワイトフラットボトムプレート	コーニング	3570
寒天菌(オキソイド)	漁夫	OXLP0011B
ラクトースブロス(オキソイド)	漁夫	OXCM0137B
炭酸水素ナトリウム	漁夫	BP328-500
トリケーン-S (MS-222)	漁夫	NC0872873
トリプトン	漁夫	BP1421-500
ウシ血清アルブミン	インビトゲン	15561020
滅菌レーヨン綿棒	医療用ワイヤー&機器	MW-113
Coomassie Bradford試薬	刺す	23200
カスパーゼグロ3/7	プロメガ	G8090
HEPESバッファー	シグマ・アルドリッチ	H0887-20ミリリットル
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	1374248から1G
ゼラチン加水分解物 Enzymatic	シグマ・アルドリッチ	G0262
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、pH 7.2(1X)	サーモ/ライフ	20-012-043
プレップマン	サーモ/ライフ	4318930
TaqMan ファストアドバンスドマスターミックス	サーモフィッシャー	4444556
クロロックス漂白剤	クロロックス
エタノール、200プルーフ、分子グレード	漁夫	BP2818500
ZEISS Axio Scan蛍光ミスクロスコープ	カールツァイス		蛍光顕微鏡
3.2mmステンレス鋼ビーズ	バイオスペック	11079132SS
プライマーITSI-3 Chytr(5'-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3')	タクマン		プライマーとプローブの個別設計
プライマー5.8S Chytr(5'-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3')	タクマン		プライマーとプローブの個別設計
マイナーグルーブバインダープローブChytr MGB2(5'-CGAGTCGAAC-3')	タクマン		プライマーとプローブの個別設計
Rotor-Gene qPCR機器	キアゲン		qPCRマシン
微量遠心チューブ 1.5ml	漁夫	02-681-372
細胞培養用ペトリプレート	ヌンク	263991
ミニビーズビータージルコーニア-ケイ酸塩ビーズ、0.5mm	バイオスペック	11079105Z

名 名 (代表)