食作用アッセイ:ショウジョウバエの胚細胞におけるアポトーシス細胞の包みを視覚化するための免疫染色技術

要約

出典:野中、S.他ショウジョウバエ胚のアポトーシス細胞の食作用アッセイ。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、Drosophila melanogasterの均質化された胚細胞におけるアポトーシス細胞の飲み込みを可視化する免疫染色技術を示しています。この方法は、アポトーシス細胞の巻き込みの程度を決定することにより、細胞生理学に関する洞察を提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 血球の染色

1. 抗Croquemort抗体による免疫染色
   1. スライドガラスをメタノールに10分間、0.2%(v/v)Triton X-100を含むPBSに10分間、次にPBSに10分間連続浸漬します。
   2. 0.2%(v/v)Triton X-100を含むPBSに5%(v/v)全豚血清20μLを20μLを封入してブロッキングします。スライドを室温で20分間インキュベートします。
   3. スライドガラスから溶液を取り出し、0.2%(v/v)Triton X-100を含むPBS中の抗Croquemort抗血清(0.1%(v/v))20μLを細胞上にマウントします。スライドを4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 0.2%(v/v)Triton X-100を含むPBSにスライドガラスを10分間5回浸
   漬します。
   5. スライドガラスをPBSに10分間浸します。
   6. 0.2%(v/v)Triton X-100および5%(v/v)全豚血清を含むPBS中のアルカリホスファターゼ標識抗ラットIgG(0.5%(v/v))20μLを室温で細胞上に1時間マウントします。
   7. 0.2%(v/v)Triton X-100を含むPBSにスライドガラスを10分間5回浸
   漬します。
   8. スライドガラスを100 mM Tris-HCl、pH 9.5、100 mM NaCl、および50 mM MgCl2を含むバッファーに10分間浸漬します。
   9. 0.23 mg/mL 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、0.35 mg/mL ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、100 mM Tris-HCl、pH 9.5、100 mM NaCl、および50 mM MgCl₂を含むホスファターゼ基質溶液を細胞にマウントします。
   10. 顕微鏡で細胞を観察し、適切に染色します。血球の顆粒に強い紫色のシグナルが現れたら、基質溶液を除去し、スライドガラスを10 mM Tris-HCl、pH 8.5、および1 mM EDTAからなるバッファーに浸します。約5〜10分間の染色をお勧めします。

2. TUNELによるアポトーシス細胞の染色

1. スライドガラスをPBSに5分間浸します。
2. 新しいPBSで繰り返します。
3. 平衡化バッファー(材料表を参照)を細胞に10分間マウントします。
4. スライドガラスから溶液を取り出し、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ5 μLと反応バッファー15 μLを含むTdT溶液20 μLを細胞上に37°Cで1時間マウントします。
5. スライドガラスから溶液を取り出し、0.5 mLのSTOP/Washバッファーと17 mLの水からなるバッファーにスライドを浸します。
6. スライドをPBSに5分間3回浸します。
7. 20 μLの抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼを細胞に室温で30分間マウントします。
8. スライドガラスをPBSに5分間4回浸します。
9. スライドガラスを、3,3'-ジアミノベンジジン四水素塩化物(DAB)の完全なマイクロスパチュラを含むpH7.5の50 mM Tris-HCl、および0.002%(v / v)H₂O₂からなるペルオキシダーゼ基質溶液に30秒間浸します。
10. アポトーシス細胞が茶色に染色されるまで、上記の手順を繰り返します。スライドガラスを水に浸してペルオキシダーゼ反応を止めます。
11. 細胞を水で囲んで観察します。

3. アポトーシス細胞の食作用のレベルを測定する

1. 食作用のレベルを評価するために、光学顕微鏡でサンプルを観察します。Croquemort陽性細胞またはGFP陽性細胞を血球として、TUNEL陽性細胞をアポトーシス細胞として、ダブル陽性細胞を食作用血球としてカウントします。
2. 食作用指数は、Croquemort陽性細胞またはGFP陽性細胞の総数に対する二重陽性細胞の数として定義されます。300以上の血球を観察することが推奨される。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
全豚血清	MPバイオメディカル	55993	ブロッキング用
Kpl 抗ラット IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPLの	〒475-1612	抗Croquemort抗体による染色血球の二次抗体
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸	ロシュ	11383221001	BCIP、血球の染色用
ニトロブルーテトラゾリウム	ロシュ	11383213001	NBT、血球の染色用
抗Croquemort抗体			以前にManaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
APOP タグペルオキシダーゼ In Situ アポトーシス検出キット	ミリポア	S7100	アポトイト細胞の染色に。このキットには、平衡化バッファー、反応バッファー、STOP/洗浄バッファー、TdT酵素、および抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼが含まれています。
3,3'-ジアミノベンジジン四水塩化	ナカライ・テスク	11009から41	DAB、アポトート細胞の染色用

に記載 シリーズ 物