Fixed Cell Efferocytosis Assay:蛍光顕微鏡を用いたマクロファージによるアポトーシス細胞のエフェロサイトーシス取り込みを研究する方法

要約

出典:Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用してアポトーシス細胞のクリアランスを研究するエフェロサイトーシスアッセイを実演します。エフェロサイトーシスは、アポトーシス細胞が食細胞に飲み込まれ、エフェロソームと呼ばれる小胞内で分解される多段階のプロセスです。このプロトコルは、個々のアポトーシス細胞の内在化部分と非内在化部分を視覚化し、エフェロサイトーシスを定量化する方法を提供します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. THP-1単球細胞株の培養と調製

1. THP-1単球をT25フラスコの懸濁培養液として、37°C+5%_CO2で培養します。細胞は、5 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640(RPMI 1640)+ 10%ウシ胎児血清(FBS)で増殖する必要があります。
2. 毎日、フラスコを静かに振って増殖培地全体に細胞を均一に懸濁し、すぐに血球計算盤で細胞をカウントします。細胞密度が1 x 10⁶細胞/mLに達したら、細胞を継代する必要があります。
   1. 37°CのウォーターバスでRPMI 1640 + 10% FBSを温めます。
   2. 2 x 10⁵細胞を1.5 mLの微量遠心チューブまたは15 mLのコニカルチューブに移し、500 x gで室温で5分間遠心分離して細胞をペレット
   化します。
   3. 細胞ペレットを乱さずに上清を除去し、1 mL(1.5 mL微量遠心チューブ)または5 mL(15 mLコニカルチューブ)のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
   4. チューブを500 x gで室温で5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずにPBSを取り出します。
   5. ペレットを新鮮なRPMI 1640 + 10% FBSの1 mLに再懸濁します。
   6. 新しいT25フラスコに4mLの温めた培地を入れ、これに1.2.5から再懸濁した細胞を加えます。37°C + 5% CO₂インキュベーターで、細胞が継代が必要になるまで(通常は3日間)、または細胞が実験に必要になるまで培養します。
3. THP-1由来マクロファージを用いた実験では、継代前に必要な数の細胞をフラスコとプレートから取り出します。
   1. 必要な数の18 mm円形ガラスカバースリップ(#1.5厚さ)を12ウェルプレートのウェル(通常は条件および/または時点ごとに1枚のカバースリップ)に入れます。各ウェルに5 x 10⁴ THP-1単球を分注します。各ウェルに添加される細胞の数は、必要に応じて変更することができます。
   2. RPMI + 10% FBSを37°Cに温めて、各細胞含有ウェルの総容量を1 mLにします。
   3. 100 nM ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) を各ウェルに添加し、3 日間培養して THP-1 単球のマクロファージ様細胞への分化を誘導します。

2. J774.2マクロファージ細胞株の培養と調製

1. J774.2細胞をT25フラスコで37°C+5%CO₂で培養します。細胞は、5 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)+ 10% FBSで増殖し、培養液が80〜90%のコンフルエンシーに達したら継代する必要があります。細胞を継代するには:
   1. フラスコからすべての培地を取り出し、5 mLのPBSで1回持ち上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI 1640 のメディア	ヨーロッパバイソン	3500-000-EL
DMEMメディア	ヨーロッパバイソン	319-005-CL
ウシ胎児血清(FBS)	ヨーロッパバイソン	〒080-150
PBSの	ヨーロッパバイソン	311-010-CL
18 mm円形ガラスカバースリップ#1.5厚さ	電子顕微鏡科学	72290から08	カバースリップのサイズと形状は重要ではありませんが、18 mmは標準的な12ウェルプレートのウェルに収まるため、細胞培養が簡単になります
スタウロスポリン	ケイマンケミカル	81590	DMSOに1 mM(1,000倍ストック溶液)で溶解します。
アネキシンV-アレクサ488	サーモフィッシャー	R37174
EZ-Link NHS-ビオチン	サーモフィッシャー	20217	デシケーターに保管してください。原液は調製しないでください。
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D2650
セルトレースファーレッド	サーモフィッシャー	C34572
CellTrace オレンジ	サーモフィッシャー	C34851
ヘシュト33342	サーモフィッシャー	62249
FITC-ストレプタバジン	サーモフィッシャー	SA1001
リンパ軟質-ポリ細胞分離培地	シダーレーンラボ	CL5071
組換えヒトM-CSF	ペプロテック	200から04
組換えヒトIL-4	ペプロテック	300〜25
J774.2 マクロファージ細胞株	シグマ・アルドリッチ	85011428から1VL
THP-1ヒト単球細胞株	ATCCの	TIB-202
Jurkat T細胞株	ATCCの	TIB-152