腸内酸性化モニタリングアッセイ:ブロモフェノールブルー色素を使用してショウジョウバエの腸管腔の酸性化を研究する技術

要約

出典:Abu, F., et al.成体のショウジョウバエ腸における腸の酸性化を監視します。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオは、ショウジョウバエの腸内酸性化を監視するためのアッセイを示しています。pH指示薬染料を添加した食品を摂取した後、腸管腔の酸性化により染料の色が変化します。ハエの消化管を目視検査して色の変化を調べると、酸性化の証拠が得られます。

プロトコル

>注:標準的な実験室ラインOregon RはWTコントロールとして使用されました。すべてのハエは、標準的なコーンミール-糖蜜培地(糖蜜、寒天、酵母、コーンミール、テゴセプト、プロピオン酸、および水を含む)で室温で飼育され、12/12時間の明暗概日リズムで飼育されました。

1. アッセイの準備

1. CO₂麻酔下でメスのハエ(生後0〜2日、非処女)を収集し、実験の少なくとも3日間は標準的なコーンミール食品で回復させます。
2. 室温(~23°C)で、~2 mLの脱イオン水に浸した実験室用ワイプティッシュが入ったバイアルで、ハエを~24時間飢餓状態にします。
3. 次のようにブロモフェノールブルー(BPB)を含むフライフードを準備します。
   1. フライフードを電子レンジで溶かし、ぬるま湯になるまで冷まします。
   2. ぬるま湯の食品1mLに4%BPB1mLを加えてよく混ぜます。
   3. ピペットを使用して、BPBを含むフライフードをペトリ皿の中央にある1つのドット(~200μL)に加えます。

2. 腸内酸性化モニタリングアッセイ

1. 飢餓状態のハエを、2%ブロモフェノールブルー(BPB)を添加したハエ用食物の1つのドット(200μL)を含むシャーレに移します。ハエが光にさらされている間、室温で4時間採餌できるようにします。
2. 4時間後、ハエを採取し、氷の上で麻酔をかけ、腸を外科的に分離します。
   1. 実体顕微鏡下で鉗子を使用して、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で手術を行います(材料の表を参照)。一対の鉗子で胸部を保持し、腸のCCRが見えるまで2番目の鉗子で腹部を引き下げて腸を分離し、腸が両端に付着したままになるように注意します。
3. 腸のCCRの色を調べて、腸の酸性化を判断します(図1C;黄色は酸性化していること、青は酸性化していないことを示します)。
4. 腸内でしっかりとしたBPB染色を示すハエだけを数えてください。
5. 次の式を使用してパーセンテージを計算します:
   腸が酸性化されたハエの割合=酸性化されたハエの数×100 /(酸性化されたハエの数+酸性化されていないハエの数)
   手記：パーセンテージ 0 は腸を酸性化したハエがいなかったことを示し、パーセンテージ 100 はすべてのハエが腸を酸性化したことを示します。

結果

図1:腸の酸性化モニタリング。(A)給餌アリーナの概略図。青い点は、ブロモフェノールブルー(pHを示す色素)を含むフライフードを表しています。他のスポットはショウジョウバエを表しています。(B)腸の酸性化を示すハエの割合をグラフで表したもので、4時間にわたってさまざまな期間給餌されました。酸性化した腸と酸性化していない腸の代表的な腸画像。赤い矢印は、中腸の銅セル領域における酸性放出を示しています。 n = 4回の実験、1回の実験で25〜30匹の雌のハエがいます。スケールバー=各500μm。アスタリスクは、対照群との有意差を示します(一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ検定) *P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.0001 です。(C) ハ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブロモフェノールブルー	シグマ・アルドリッチ		B0126
D.シミュラン	カリフォルニア大学のショウジョウバエ種ストックセンター		リバーサイドカリフォルニア1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D.エレクタ	カリフォルニア大学のショウジョウバエ種ストックセンター		デレcy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D.シュードオブスキュラ	カリフォルニア大学のショウジョウバエ種ストックセンター		オレゴン州ユージーン(https://www.drosophilaspecies.com/)
D.モハベンシス	カリフォルニア大学のショウジョウバエ種ストックセンター		カリフォルニア州チョコレートマウンテンズ(https://www.drosophilaspecies.com/)
鉗子	イノックスバイオロジー		カタログ#11252-20
キムワイプティッシュ	キムテック
オレゴンR	ブルーミントンショウジョウバエ株		(https://bdsc.indiana.edu/#2376)
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック		カタログ #FB0875713A
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ハイクローン		カタログ # SH30258.01
実体顕微鏡	オリンパスSZ51		視覚倍率