ミトコンドリアカルシウム取り込みアッセイ:単離されたミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みを測定するためのプレートリーダーベースの方法

要約

出典:Maxwell, J.T., et al., Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するためのプレートリーダーベースのアッセイについて説明しています。このアッセイは、カルシウム感受性蛍光色素の蛍光シグナルを解析し、ミトコンドリアのカルシウム取り込みとカルシウム過剰の動態を研究します。

プロトコル

1. 試薬と溶液

1. ミトコンドリア単離用のMS-EGTA緩衝液500 mLを調製します:225 mMマンニトール、75 mMスクロース、5 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1 mMエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)、KOHでpHを7.4に調整。0.22 μmのフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。MS-EGTAバッファーを4°Cに事前に冷却してから使用してください。
2. 100 mLのKCl Bufferを調製します:125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH₂PO₄、2 mM MgCl₂、40 μM EGTAおよびKOHでpHを7.2に調整します。室温で保存してください。
3. ジメチルスルホキシド(DMSO)に1 mMカルシウムグリーン-5Nストックを調製します。カルシウムグリーン-5Nストックは、-20°Cで分注して保存できます。
4. Ca²⁺取り込み用の基質を調製します。
   1. 1 Mピルビン酸ナトリウム、pH 7.4を調製します。-20°Cのアリコートで保存してください。
   2. 500 mMのリンゴ酸、pH 7.4を調製します。-20°Cのアリコートで保存してください。
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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Synergy Neo2 マルチモードマイクロプレートリーダー (インジェクター付き	ビオテック
ティッシュホモジナイザー	キンブル	886000-0022
96ウェルプレート	コーニング	3628
カルシウムグリーン-5N	インビトゲン	C3737
DMSOの	インビトゲン	D12345
ヘープス	シグマ	H3375-J
エグタ	シグマ	E8145
塩化カリウム	漁夫	BP366-500
塩化マグネシウム	シグマ	M2670
ピルビン酸ナトリウム	シグマ	P2256
L-リンゴ酸	シグマ	M1125
塩化カルシウム	シグマ	C4901
リン酸カリウム一塩基性	シグマ	P0662

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