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1. 試薬と溶液
- ミトコンドリア単離用のMS-EGTA緩衝液500 mLを調製します:225 mMマンニトール、75 mMスクロース、5 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1 mMエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)、KOHでpHを7.4に調整。0.22 μmのフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。MS-EGTAバッファーを4°Cに事前に冷却してから使用してください。
- 100 mLのKCl Bufferを調製します:125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH2PO4、2 mM MgCl2、40 μM EGTAおよびKOHでpHを7.2に調整します。室温で保存してください。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)に1 mMカルシウムグリーン-5Nストックを調製します。カルシウムグリーン-5Nストックは、-20°Cで分注して保存できます。
- Ca2+取り込み用の基質を調製します。
- 1 Mピルビン酸ナトリウム、pH 7.4を調製します。-20°Cのアリコートで保存してください。
- 500 mMのリンゴ酸、pH 7.4を調製します。-20°Cのアリコートで保存してください。
2. 心電ミトコンドリアの単離
- 制度の基準に従ってマウスを安楽死させる
手記：私たちの制度的に承認された安楽死の方法では、マウスはイソフルオラン吸入によって麻酔され、子宮頸部脱臼によって犠牲にされました。
- 胸腔を開き、肋骨の両側に沿って切り込み、心臓の側面に接し、横隔膜を切り取り、心臓組織を切除することにより、心臓を収集します。
手記：このプロトコルでは、成体マウス(約120mg)から採取した全心臓からミトコンドリア単離を行い、これは3〜4回の実験に十分であるはずです。肝臓などの他のミトコンドリアに富む組織からのミトコンドリア単離のために、記載されているプロトコルに従って最大200mgの組織を使用することができる。
- 氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の25mLで組織を徹底的にすすぎ、すべての血液が心室から絞り出されるようにします
手記：心臓から絞り出された液体が透明になると、心臓は十分にすすが れます。
- 鋭利なハサミを使用して、5 mLの氷冷した1x PBSで心臓を細かく刻みます。
- PBSを廃棄し、ミンチした心臓組織を、0.10〜0.15mmのクリアランスで事前に冷却した7mLガラステフロンデュースホモジナイザーに移します。.
- 氷冷したMS-EGTAバッファー5 mLを加え、組織片が見えなくなるまでサンプルを均質化します(約11ストローク)
手記：無傷で機能的なミトコンドリアを得ることが目標であるため、組織を過度に均質化しないでください。
- ホモジネートを15mLチューブに移します。
- ホモジネートを600 x g、4°Cで5分間遠心分離し、核と壊れていない細胞をペレット化します。
- 上清を新鮮な15 mLチューブに移し、10,000 x g、4°Cで10分間遠心分離し、ミトコンドリアをペレット化します。
- 上清を捨て、ミトコンドリアペレットを氷の上に保ちます。
- ミトコンドリアペレットを氷冷MS-EGTA緩衝液を用いて2回洗浄します。洗浄するたびに、ミトコンドリアペレットを5 mLのMS-EGTAバッファーに再懸濁し、10,000 x g、4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 最終洗浄後、上清を捨て、ミトコンドリアを氷冷したMS-EGTA緩衝液100μLに再懸濁します。ミトコンドリアを氷の上に保ちます.
手記：ミトコンドリアは1時間以内に実験に使用する必要があります。
- Bradford Protein Assayを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を測定します。
3. プレートリーダーによるミトコンドリアカルシウム取り込みの測定
>注:ここでは、インジェクターを装着したマルチモードプレートリーダーを使用してミトコンドリアCa2+取り込みを分析するためのプロトコルについて説明します。反応を光から保護するための自動試薬インジェクターを備えたキネティックモードでカルシウムグリーン-5N蛍光(506/532nmの励起/発光)を読み取る機能を備えたプレートリーダーであれば、どれでも使用できます。
- プレートリーダーをプログラムして、合計アッセイ時間 1,000 秒で 1 秒ごとに測定を行い、カルシウム グリーン-5N 蛍光の動的読み取りを実行します。さらに、試薬インジェクターをプログラムして、30 秒、150 秒、300 秒、480 秒、および 690 秒の時点で 5 μL の CaCl2 溶液を分注します。
手記：CaCl2注入のタイミングはユーザー定義であり、実験のニーズに応じて調整できます。
- 使用するCaCl2溶液で試薬インジェクターをプライミングします
手記：CaCl2溶液の濃度はユーザー定義であり、その後の実行で調整して、MPTPの開放をトリガーするために必要なCa2+の量を滴定できます。
- 200 μgのミトコンドリアを96ウェルプレートの個々のウェルに加えます。
- ミトコンドリアとKClバッファーの合計容量が197μLになるように、適切な量のKClバッファーをウェルに加えます。
- 1 μL の 1 M ピルビン酸と 1 μL の 500 mM リンゴ酸をミトコンドリア混合物に加えます。ピペットで穏やかに混合し、ミトコンドリアを基質と室温で2分間インキュベートして、ミトコンドリアが活性化
するまで待ちます。
- 1 μLの1 mMカルシウムグリーン-5Nストックを添加します。ピペッティングで穏やかに混合します.
手記：カルシウムグリーン-5N色素の添加後の反応を光から保護します。
- 事前にプログラムされた速度論的プロトコルを開始し、カルシウムグリーン-5N蛍光をモニターします。