細胞透過性ペプチドとメンブレンとの相互作用を研究するための蛍光リークアッセイ

要約

出典:Konate, K. et al.細胞透過性ペプチドによる膜の不安定化を調べる蛍光リークアッセイ。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、細胞膜模倣物(蛍光色素とクエンチャーでカプセル化された大きな単層小胞、またはLUV)を使用して、細胞透過性ペプチドと細胞膜との相互作用を研究する蛍光漏出アッセイについて説明します。

プロトコル

1. 大型単層小胞(LUV)の調製

1. 蛍光リークアッセイの細胞膜模倣物として使用するためのLUVを調製します。
2. ハミルトンガラスシリンジ ホスファチジルコリン (DOPC, 786.11 g/mol)、スフィンゴミエリン (SM, 760.22 g/mol)、コレステロール (Chol, 386.65 g/mol) とモル比 4:4:2 で混合します。脂質溶液は、25 mLのガラス丸底フラスコ中のメタノール/クロロホルム(3/1;容量/容量)溶媒に25 mg/mLで可溶化した各脂質のストック溶液から得られます。4μmolのDOPC、4μmolのSM、および2μmolのCholに基づいて、脂質溶液は、それぞれ126μL、117μL、および31μLを混合することにより、ストック溶液から得られます
   注意：メタノールは有毒で可燃性の溶媒であり、クロロホルムは有毒で発がん性があります。どちらもフードの下で適切な保護具で取り扱う必要があります。
3. ロータリーエバポレーターを使用して、乾燥脂質膜が形成されるまで、真空下60°Cで45〜60分間メタノール/クロロホルムを蒸発させます。
4. 2つのストックHEPES緩衝液を調製します。20 mM HEPES(238.3 g/mol)と75 mM NaCl(58.44 g/mol)を混合してHEPES緩衝液1を調製し、pHを7.4に調整します。20 mM HEPESと145 mM NaClを混合してHEPESバッファー2を調製し、pHを7.4に調整します。HEPESバッファーは、4°Cで1ヶ月間保存できます.
   手記：浸透圧計を使用してバッファーの浸透圧を確認することをお勧めします。
5. 膜不透過性蛍光染料消光剤カップル、8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸、二ナトリウム塩12.5 mM(ANTS、427.33 g/mol)、p-キシレン-ビスピリジニウムブロマイド45 mM(DPX、422.16 g/mol)をHEPES緩衝液に溶解して、脂質水和液を調製します。ANTSとDPXを混合すると、黄色の溶液が得られます。12.5 mM の ANTS と 45 mM の DPX の濃度を達成するには、それぞれ 21.4 mg と 76 mg を 4 mL の HEPES バッファー 1.
   に溶解します 手記：脂質水和液は、チューブをアルミホイルで包むことにより、4°Cで2週間保存できます。
6. 乾燥脂質フィルムを1mLの脂質水和溶液で再懸濁し、乾燥脂質フィルムが溶解するまでボルテックスすることにより、マルチラメラ小胞(MLV)を再構成します。.小さな脂質凝集体は前のステップに悪影響を与えるため、溶液が完全に可溶化されていることを確認してください。また、ガラス製の丸底フラスコの壁をチェックして、脂質膜が残っていないことを確認します
   手記： 溶液は、可溶化後、乳白色で淡黄色に見えます。
7. 小胞を5回の凍結/融解サイクルにさらして、単層小胞を取得します。ガラスの丸底フラスコを液体窒素に30秒間入れて凍結ステップを行い、次に水浴に2分間置いて解凍ステップすることにより、各サイクルを実行します.
   手記：お風呂の水の温度は、脂質の融解温度よりも5〜10°C高くする必要があります。
8. 金属押出機キャニスターに配置された各ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)押出機片にHEPES緩衝液で予備加湿した2つのフィルターサポートを挿入して、脂質押出機を準備します。
9. HEPES加湿ポリカーボネートメンブレン(孔径0.1μm、直径25mm)を1つのフィルターサポートの上に置きます。
10. 2つの金属押出機キャニスターを組み立て、ねじ込みます。
11. 組み立てたエクストルーダーをホルダーに入れ、各ポリテトラフルオロエチレンエクストルーダーピースの先端にある適切な穴に1mLシリンジを導入します。押出しは、ポリカーボネート膜を通る一方のシリンジから他方のシリンジへの試験された液体の通過に対応します。
12. 1 mLシリンジの1つに1 mLのHEPESバッファーを装填して押出機をテストし、漏れや問題がないことを確認します。
13. 1 mL HEPESバッファーをMLVサンプルと交換します。
14. MLVサンプルを一方のシリンジからもう一方のシリンジにポリカーボネートメンブレンを介して少なくとも21回通過させることにより押出しを行い、同じサイズの均一なLUVを取得します
    手記：押出しは、脂質混合物の融解温度よりも高い温度で行う必要があります。

2. LUVの精製

1. カプセル化されていないANTSおよびDPXの過剰を除去するためのカラム精製を調製します。
2. 架橋デキストランゲル(G-50)を0.01%NaN₃(65 g/mol)を含む水性媒体に再懸濁した液体クロマトグラフィーカラム(ルアーロック、ジャケットなし、1.0 cm x 20 cm、ベッド容量16 mL)に、カラムの無色部分の上部から最大1 cm下まで導入します。
3. 蛇口を開けて液体を流し、架橋デキストランゲルを沈殿させます。
4. 20 mLのHEPESバッファー2で溶出してカラムを洗浄し、カラムの出力フローを廃棄します。
5. カラム上の溶媒のデッドボリュームが最小限に抑えられ(<100 μL)、架橋デキストランゲルの乾燥を防ぐのに十分になったら、タップを閉じます。
6. 新たに押し出したLUV(黄色)をカラムに置き、架橋デキストランゲルに侵入させます。
7. HEPESバッファー2をカラムに連続的に添加して、LUV精製を行います。
8. 約2 mLのHEPES緩衝液2を溶出します(架橋デキストランゲルの乾燥を避けるために、カラムの上部を定期的に充填することを忘れないでください):遊離黄色のANTSおよびDPX溶液は、リポソームよりもゆっくりと移動します。
9. 精製されたLUVをチューブ(1.5 mL)に集め始めます。
10. カラムからの溶離液の滴を観察し、乳白色になるとリポソームが含まれています。チューブを交換して、LUVを含む画分を回復します。
11. 液滴が乳白色でなくなるまで溶出します(~1 mL)。その後、別の画分でさらに0.5 mLを溶出し、溶出を停止します
    注:標準物質は、LUVの溶出量を較正するためのキットまたは個々の分子量として、幅広い分子量で利用できるようになりました。
12. 蛍光色素の漂白を避けるために、チューブをLUVでアルミホイルで包みます。
13. カラムを20 mLのHEPESバッファー2で洗浄します。
14. その後、LUVは4°C.
    で1週間保存できます 注:LUVの安定性はLUVの濃度と組成、およびイオン強度に依存する可能性があるため、LUVのサイズは動的光散乱(DLS)装置を使用して制御する必要があります(セクション4を参照)。LUVサイズと均質性の特性評価)を各テストの前に行います。

3. LUVの濃度を定量化する

1. リン脂質定量キットによりLUV濃度を推定し、コリン濃度の評価を可能にします。このアッセイは、極性頭部を含むコリンを含むリン脂質が相当な量(LUVの>50%)である場合に適用できます。
2. 18 mgの発色基質を付属のバッファー3 mLに溶解して、カラー試薬を調製します。
3. ポリスチレンキュベット(10 x 10 x 45 mm)に3 mLのカラー試薬をロードします。
4. 純色試薬をブランク状態(ブランク)として使用します。20 μL の LUV サンプル (テスト) または 20 μL の既知のコリン濃度の標準溶液 (標準溶液) を添加します。
5. よく混合し、すべての条件(ブランク、テスト、スタンダード)で37°Cで5分間インキュベー
トします。
6. 分光光度計で600nmのブランク溶液をコントロールとして、試験サンプルと標準溶液の吸光度(光学濃度、OD)を測定します。
7. 既知の濃度の標準と比較して、LUVs、C[LUV]の脂質濃度をコリン当量で推定できるOD値を確認してください。
8. 次の式を使用して計算を実行します:
   C[LUV] (mol / l) = (ODサンプル/ OD標準) x C[標準] (mol / l)
   注:リン脂質定量キットは、C[標準]= 3.87 mmol / Lのモル濃度に対応する54 mg / dLの塩化コリン(139.6 mg / l)標準溶液を提供しました。

4. LUVサイズと均質性の特性評価

1. DLS装置を使用して測定を行い、LUVサイズ(nm)と多分散指数(PdI)を決定します。
2. 適切な「標準操作手順」(SOP)を、溶媒/バッファーと使用済みキュベットの粘度を示すことによりプログラムします。
3. 500 μLのLUV溶液をポリスチレンセミマイクロキュベットに入れます。
4. ポリスチレンセミマイクロキュベットをDLS機器に挿入します。
5. 室温で、粒子分布の平均サイズ(Z平均)と均質性(多分散指数、PdI)でサイズ分布を測定します。
6. すべての結果は、それぞれ 3 回の反復サイクルで実行された 2 つの独立した測定から得られます。
   注:LUVの標準値は、平均サイズ137±7nm、PdIは0.149±0.041です。

5. ペプチド溶液の調製

1. ペプチドのストック溶液を調製し、リークアッセイのために分析する必要があります。
2. ペプチド粉末(純度>95%)を純水(例:500μLの純水に1mgのペプチド)に溶解します。
   手記： ペプチドは純水で希釈し、アーティファクト(膜透過化など)を誘発する可能性のあるジメチルスルホキシド(DMSO)の可溶化を避けることをお勧めします。
3. ペプチド溶液を5秒間ボルテックスします。
4. ペプチド溶液を水超音波処理槽で5分間超音波処理し、次いで12,225 x gで5分間遠心分離する。濃度測定のために上清を採取します。
5. 3つの独立したペプチド希釈液の280 nmでの吸光度を測定し、モル吸光係数ε(ペプチド配列のトリプトファンとチロシンの含有量に依存)とランベルトビールの法則を使用してペプチド濃度を計算します
   手記：ペプチドにトリプトファンとチロシンが含まれている場合、モル吸光係数εは、トリプトファン ε = 5,690 ^{M-1 cm-1} および チロシン ε = 1,280 ^{M-1 cm-1} に基づいて計算されます。ペプチド配列にトリプトファンやチロシンが含まれていない場合は、他の比色分析法を実施して濃度を測定することができます(例:BCAまたはBradford)。
6. ペプチド溶液を純水で希釈して最終溶液100μMにし、4°Cで保存します
   手記： 純水では、4°Cでの保存中にペプチドの分解は起こりません。ただし、ペプチド濃度は、水分の蒸発が発生しないように2週間ごとに測定する必要があります。

6. 蛍光リークアッセイ

1. 蛍光リークアッセイは、室温の分光蛍光光度計で測定されます。励起波長はEx=360nm±3nm、Em=530nm±5nmでそれぞれ固定されています。
2. LUVを1 mL HEPESバッファー2で希釈し、石英蛍光キュベットで最終濃度100 μMにします。マグネチックスターラーを追加して、実験中に溶液を均質化します。
3. バックグラウンド蛍光にアクセスするために、最初の 100 秒間、t = 0 秒から t = 99 秒の間の LUV のみを測定します。
   手記： LUVは、バックグラウンドの蛍光や潜在的なリークにアクセスするために、実験全体(15分)で単独で測定することもできます。
4. その後、次の 900 秒 (15 分) のペプチド溶液のアリコートの添加による蛍光強度の増加として漏れを測定します。このプロトコルは、0.1μMから2.5μMまで試験したペプチドの各濃度に対して実施されます。
5. 最後に、1 μL の Triton X-100 (0.1%, v/v) を添加して LUV を可溶化することにより、100% の蛍光が達成され、t = 1,000 s から t = 1,100 s の間のプローブが完全に消光されなくなりました。

7. 漏れの定量化

1. t = 1,090 秒後に得られる値を抑制して、テストされた各条件で同じポイント数を維持します。
2. t = 0 s から t = 49 s (LUV のみ) の間の 50 ポイントの平均を作成することにより、最小蛍光 F_min を計算します。
3. t = 1,041 秒から t = 1,090 秒 (Triton X-100 を使用した LUV) の間の 50 ポイントの平均を作成して、最大蛍光 F_max を計算します。
4. 各時点 (t = x) での漏れの割合 (%Leak) を、次の式に従って計算します。
   %リーク_(t=x) = (F_(t=x) - F_min) / (F_max - F_min) x 100
5. 同じ条件について、異なるLUV調製(n ≥ 2)で得られた値の平均と標準偏差を計算します。
6. 漏れの割合 %Leak_(t=x) を時間 (s) の関数でプロットします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
25mLガラス丸底フラスコ	パイレックス
8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸、二ナトリウム塩(ANTS)	インビトゲン	A350型機	光からの保護
クロロホルム	シグマ・アルドリッチ	288306
コレステロール	シグマ・アルドリッチ	C8667
DOPC(ジオレオイルホスファチジルコリン)	アバンティポーラー	850375P	空気から保護する
押 出 機	アバンティポーラー	610000
蛍光計	PTIセラーボ
50 μL ガラス製シリンジ	ハミルトン	705N
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
LabAssay リン脂質	和光	〒296-63801
液体クロマトグラフィー用カラム	シグマ・アルドリッチ
メタノール	カルロ・エルバ	414902
核細孔ポリカーボネート膜(孔径0.1μm、直径25mm)	ワットマン	800309
ポリスチレンキュベット、10 x 10 x 45 mm	グレナーバイオワン	614101
ポリスチレン製セミマイクロキュベット、DLS	フィッシャーサイエンティフィック	FB55924
p-キシレン-ビスピリジニウムブロマイド(DPX)	インビトゲン	X1525	光からの保護
石英蛍光キュベット	ヘルマ	109.004F-QSの
ロタバポシステム	ハイドルフ	Z334898
セファデックスG-50樹脂	アマルサム	〒17-0042-01
アジ化ナトリウム(NaN3)	シグマ・アルドリッチ	S2002
塩素化ナトリウム(NaCl)	シグマ・アルドリッチ	S5886
ソニケーターバスUSC300T	VWRの	〒142-6001
スフィンゴミエリン	アバンティポーラー	860062P	空気から保護する
トリトンX-100	エロメデックス	2000年B期
ゼータジザー NanoZS	マルバーン	ZEN3500

年