植物組織中の可溶性タンパク質含有量を定量するための可溶性タンパク質アッセイ

1. 植物の収集と加工

1. プラントサンプルの収集と処理
   1. 植物試料を採取した後、植物材料を鉗子で液体窒素に浸して試料を急速凍結し、-80°Cで保存します。採取した植物サンプルが大きすぎて急速冷凍できない場合は、ドライアイスを使用してサンプルをすばやく冷却し、できるだけ早く-80°Cの冷凍庫に移します。植物材料の主要栄養素含有量は、組織が植物から分離された後に変化する可能性があるため、収集後できるだけ早く植物サンプルを凍結することが重要です
      注意: 液体窒素は、皮膚に接触すると重度の凍傷を引き起こす可能性があります。液体窒素は、承認された容器に入れて輸送し、クライオグローブ、アイゴーグル、フェイスシールド、エプロン、白衣など、取り扱い中は適切なPPEを着用してください。
   2. 凍結乾燥機を使用して植物材料を凍結乾燥し、水分が除去されている間、組織が代謝的に不活性であることを確認します。サンプルの質量が安定するまで乾燥させ、すべての水が除去されたことを確認します。
   3. サンプルが乾いたら、グラインダーまたはミルを使用して微粉末に粉砕します。分析までサンプルを乾燥キャビネットに保管します。

2. 可溶性タンパク質アッセイ

1. サンプル調製
   1. 各組織の複製サンプル(それぞれ約20 mg)を1.5 mLのポリスチレン微量遠心チューブとラベルチューブに秤量します。これらのサンプルは、以降、不明なサンプルと呼ばれます。この情報は、各未知サンプル中の可溶性タンパク質の割合を計算するために必要になるため、各サンプルの正確な質量を記録します。ロック式の蓋付きのマイクロ遠心チューブは、その後の加熱ステップ中にロック式の蓋が開き、サンプル溶液が失われる可能性があるため、使用してください。
2. 未知のサンプルタンパク質を可溶化して単離します
   1. マイクロピペッターを使用して、各チューブに500 μLの0.1 M NaOHを加えます。蓋をしっかりと閉め、30分間超音波処理します。温水浴を予熱します 90 °C.
      注意:水酸化ナトリウムは強塩基であり、皮膚に接触すると火傷を引き起こす可能性があります。0.1 M NaOHは低濃度ですが、皮膚刺激を避けるために保護手袋を着用してください。
   2. チューブを温水浴のラックに15分間置きます。
   3. チューブを15,000 x gで10分間遠心分離します。サンプルごとに新しいピペットチップを使用して、上清液を新しい標識マイクロ遠心チューブにピペットで移します。ペレットの入ったチューブに0.1 M NaOHを300 μL加え、再度15,000 x gで10分間遠心分離します。再度、上清液を採取し、同じサンプルから他の上清液と結合します。これは潜在的な停止点であり、必要に応じてサンプルを4°Cで一晩保存することができます。
3. 植物性タンパク質の沈殿物
   1. 5.8 M HClを11 μL加えて上清溶液のpHを中和し、各サンプル溶液にリトマス紙を浸してpHが~7であることを確認します。
      注意: 塩酸は強い腐食性の酸であり、皮膚に接触すると火傷を引き起こす可能性があります(皮膚への適用または吸入)。HClを取り扱う際は、皮膚刺激を防ぐため手袋を着用してください。
   2. 各チューブに90 μLの100%トリクロロ酢酸(TCA)を加え、チューブを氷上で30分間インキュベートします。タンパク質の沈殿により、溶液は透明から不透明に変わります。30分経ってもこれが起こらない場合は、チューブを1時間冷蔵します。これは潜在的な停止点であり、必要に応じてサンプルを4°Cで一晩保存できます
      注意:トリクロロ酢酸は腐食性です。お取り扱いの際は、皮膚との接触を防ぎ、吸入を避けるため、手袋を着用してください。
   3. 13,000 x gで4°Cで10分間サンプルを遠心分離し、TCA上清を微細ガラスマイクロピペットチップに取り付けられた真空ラインを使用して吸引して慎重に除去します(同じチップをサンプル間で使用できます)。激しい吸引を避け、ピペットチップとペレットとの間に適切な距離を保つことにより、タンパク質ペレットを乱さないでください。
   4. ペレットを-20°Cのアセトン100μLですばやく洗浄します。このステップでは、ペレットから残っているTCAを除去し、その後のBradfordアッセイに干渉する可能性があります。ただし、アセトンは長時間接触しすぎるとタンパク質ペレットを溶解し始めるため、アセトンを添加してから5秒以内にペレットから迅速に抽出する必要があります。
   5. チューブをドラフトまたは冷蔵庫に入れて、アセトンを蒸発させます。次に、各チューブに0.1 M NaOHを1 mL加えてタンパク質ペレットを溶解します。ペレットを完全に溶解するには、温水浴での数回の加熱、ボルテックス、および超音波処理が必要になる場合があります
      注:チューブがドラフトまたは冷蔵庫に長く留まり、ペレットが乾燥するほど、再可溶化が難しくなります。ペレットを30分間乾燥させ、アセトンが蒸発したことが明らかになるまで、10〜15分ごとにアセトンの存在を確認することをお勧めします(アセトンの煙は検出されません)。
4. 標準溶液を混合し、未知サンプル溶液を希釈し、Bradfordアッセイを使用して未知サンプルの総タンパク質含有量を定量します。
   1. 表1に記載されている濃度に従って、ウシ免疫グロブリンG(IgG)標準溶液を調製します(凍結乾燥またはIgGストック溶液を脱イオン水と混合して各濃度を達成できます)。標準試料は4°Cで保存してください。96ウェルプレートでは、ウェルプレートのA1位置から開始して、各IgG標準溶液160 μLを3倍に添加します(A1、A2、A3位置で0 μg/μL、B1、B2、B3位置で0.0125 μg/μLなど)。
   2. 950 μLの蒸留水に50 μLの0.1 M NaOHを加えて、希釈したNaOH溶液を調製します。ブランクネガティブコントロールとして、この溶液60μLをウェルプレートに3倍(G1、G2、G3位置)で加えます。
   3. 新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブで、各サンプル溶液50 μLを950 μLの蒸留水に加えて、未知のサンプルの希釈液を調製します。次に、希釈した各サンプル60μLをH1位置からウェルプレートに3回追加します。96ウェルプレートは、トリプリケートで読み取られた場合、6つの標準試料、1つのブランク、および25の未知サンプルの分析を可能にするはずです。分析した各ウェルプレートには、独自のIgG標準サンプルとブランクサンプルが含まれている必要があります。
   4. 100 μLの蒸留水を、すべてのブランクおよび未知のサンプルウェルに加えます。マルチチャンネルピペット(8チャンネル)を使用して、ウェルプレートの最初のカラムのすべてのウェルに40 μLのCoomassie brilliant blue G-250タンパク質色素を加えます。数回急降下させて、染料をサンプルと混合します。他のすべてのカラムについても繰り返し、汚染を避けるためにピペットチップを交換します。
      注意: クマシーブリリアントブルーG-250は刺激物であり、皮膚、目、または肺との接触は避けてください。皮膚に触れないように手袋を着用してください。皮膚に付着すると、本品が汚れます。
   5. ウェル内に存在する気泡は、マイクロプレート分光光度計の読み取りを妨げる可能性があるため、針を使用してポップします。ウェル間の汚染を避けるために、ニードルを清掃します。マイクロプレートを室温で5分間インキュベートします。
   6. マイクロプレート分光光度計を使用して、595 nmで各ウェルの吸光度値を記録します。

>表 1.可溶性タンパク質アッセイの標準曲線計算。各標準試料中のタンパク質量は、各標準試料の濃度に各ウェル中の標準溶液の量(160 μL)を乗じて算出します。