植物組織中の非構造炭水化物の定量のための比色アッセイ

1. 植物の収集と加工

1. 植物試料を採取した後、植物材料を鉗子で液体窒素に浸して試料を急速凍結し、-80°Cで保存します。採取した植物サンプルが大きすぎて急速冷凍できない場合は、ドライアイスを使用してサンプルをすばやく冷却し、できるだけ早く-80°Cの冷凍庫に移します。植物材料の主要栄養素含有量は、組織が植物から分離された後に変化する可能性があるため、収集後できるだけ早く植物サンプルを凍結することが重要です
   注意：液体窒素は、皮膚に接触すると重度の凍傷を引き起こす可能性があります。液体窒素は、承認された容器に入れて輸送し、クライオグローブ、アイゴーグル、フェイスシールド、エプロン、白衣など、取り扱い中は適切なPPEを着用してください。
2. 凍結乾燥機を使用して植物材料を凍結乾燥し、水分が除去されている間、組織が代謝的に不活性であることを確認します。サンプルの質量が安定するまで乾燥させ、すべての水が除去されたことを確認します。
3. サンプルが乾いたら、グラインダーまたはミルを使用して微粉末に粉砕します。分析までサンプルを乾燥キャビネットに保管します。

2. 消化可能な炭水化物アッセイ

1. サンプル調製
   1. 各組織の複製サンプル(それぞれ約20 mg)を、ゴムで裏打ちされたスクリューキャップ(長さ100 mm)付きのガラス製15 mLチューブに秤量します。これらのサンプルは、以降、不明なサンプルと呼ばれます。防水マーカーまたは蓋にラベリングテープを貼ったラベルチューブにラベルを付け、各サンプルの正確な質量を記録します。この情報は、各未知のサンプルの%炭水化物を計算するために必要になります。
2. 各未知サンプルから消化可能な炭水化物を抽出します。
   1. 0.1 MH₂SO₄ 1 mL を各チューブに加え、キャップをチューブにしっかりとねじ込みます。沸騰したお湯の浴に1時間入れます.
      注意： 硫酸は非常に腐食性があります。_H2SO4を取り扱う際は手袋、アイゴーグル、エプロンを着用し、このステップはヒュームフードで行ってください。
   2. ぬるま湯でチューブを冷やします。ラベル付きの1.5 mL微量遠心チューブにチューブの内容物を注ぎます(ガラスチューブに植物材料が残っていても心配しないでください)。
   3. チューブを15,000 x gで10分間遠心分離します。マイクロピペッターで上清液を取り出し、新しい標識1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。この時点でチューブは一晩冷蔵できます。アッセイを続行する場合は、ステップ2.3.2を参照してください。
3. 標準溶液を混合し、未知サンプルの総消化可能炭水化物含有量を定量します。
   1. 表1に記載されている濃度のD(+)グルコース標準溶液を調製します。各標準溶液400μLを含むガラス試験管6本を調製します。
   2. 各未知サンプルを15 μLずつ独自の試験管にピペットで移し、それぞれに385 μLの蒸留水を加えて、各試験管に合計400 μLを充填します。ドラフト内で、400 μL の 5% フェノールを各標準試料試験管と未知試料試験管に加え、2 mL の濃縮 H₂SO₄ を各チューブにすばやくピペットで注入します。ピペットの先端で試験管の内容物に触れず、溶液表面に追加するだけです(これにはリピーターピペットが最適です)。
   3. チューブを10分間インキュベートした後、チューブを慎重にボルテックスして内容物を混合します。さらに30分間インキュベートします.
      注意：フェノールと硫酸は腐食性の刺激物です。皮膚、目、吸入への曝露から保護するために、この手順は、フェイスシールドまたはアイゴーグル、ゴム手袋、ラボエプロン、ブーツなどの適切なPPEを使用して、化学ドラフトで実行する必要があります。フェノールと硫酸を混合すると、発熱反応も起こり、チューブが熱くなります。
   4. 各チューブから800μLのサンプルを3つのポリスチレン1.5 mLセミマイクロキュベット(サンプルあたり3回のテクニカルレプリケート)のそれぞれにピペットで移します。分光光度計を490nmで読み取るように設定します。標準試料や未知のサンプルを読み取る前に、蒸留水が入ったブランクキュベットに校正し、サンプルの読み取り中は断続的に校正します。各キュベットを分光光度計に通し、吸光度を記録します。未知の各サンプルの技術反復全体の平均
      手記：場合によっては、サンプルが吸光度の上限しきい値を超えることがあります。その場合は、ステップ1.3.1でサンプルを希釈する必要があります。希釈は、その後の計算でも考慮する必要があります。
   5. 各標準の平均吸光度を計算します.
      手記：標準曲線を使用して各未知サンプル中に存在する総消化可能炭水化物の量を計算するには、各標準の平均吸光度を各標準に存在するD(+)グルコースのマイクログラムに対して回帰するのが最も簡単ですが、必要に応じて各標準試料のD(+)グルコース濃度(μg/μL)をプロットすることもできます。ただし、以下の計算は、濃度(μg/μL)ではなく、マイクログラムに基づく標準曲線を参照しています。
   6. 各標準溶液中のD(+)グルコース(μg)の総量に対する平均吸光度をプロットすることにより、標準曲線を計算します。これらのデータに線形回帰直線を当てはめ、次の式を使用して、未知の各サンプルの炭水化物の総量(μg)を計算します:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = サンプル中の炭水化物< μg /> A_x = 未知のサンプルの平均吸光度
      b = y切片(標準回帰直線)
      m = 傾き (標準回帰直線)
      この線の相関係数は 0.98 より大きく、通常は 0.99 に近い値になります。次に、次の式を使用して、各サンプル中の炭水化物の割合を決定します:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =%炭水化物
      M_i = サンプルの初期質量 (mg)

>表 1.消化性炭水化物アッセイの標準曲線計算。各標準試料中のグルコース量は、各標準試料の濃度に各試験管内の標準液量(400μL)を乗じて算出します