細胞内寄生虫の増殖を定量するためのルシフェラーゼベースの増殖アッセイ

要約

出典: Key, M., et al., Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay. J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、細胞内病原体であるトキソプラズマ原虫の増殖を定量化するルシフェラーゼアッセイを実演します。宿主細胞に感染した後にルシフェラーゼ酵素を発現するトキソプラズマ株を利用して、感染した細胞培養物でルシフェラーゼ活性を検出し、寄生虫の繁殖成功を決定します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ルシフェラーゼを用いたトキソプラズマ増殖アッセイ

1. 寄生虫接種の1週間前にヒト包皮線維芽細胞(HFF)を播種し、宿主細胞が完全にコンフルエントであることを確認します。透明なプレートで模擬アッセイを実施して、評価期間を通じて寄生虫が細胞内に留まることを確認します。
   手記：ここでは、アッセイは96ウェルマイクロプレートで行われます。実験的なニーズに応じて、384ウェルまたは1536ウェルのマイクロプレートまでスケールアップすることができます。
2. 使用の2日前に、~0.3-0.4 mLの完全に溶解した寄生虫をT25フラスコに移すことにより、トキソプラズマ寄生虫をコンフルエントHFFに流します。感染した宿主細胞を5%_CO2とともに37°Cで2日間インキュベートします。
3. 溶解したばかりの寄生虫5 mLを21 Gの安全針5倍に通して細胞内寄生虫を遊離させ、3 μmフィルターに通して宿主細胞の破片を除去します。7 mLのフェノールレッドフリーD10培地を使用してフラスコから残留寄生虫を洗い流し、再度フィルターを通過します。
4. 寄生虫を1000 x gで室温(RT)で10分間遠心分離します。上清を注ぎ、ペレットを10mLのフェノールレッドフリーD10培地に再懸濁します。
5. 血球計算盤を使用して寄生虫をカウントし、濃度を決定します。
6. 野生型(WT)株については、寄生虫を1 x 10⁴寄生虫/mLに希釈します。成長不全の寄生虫株については、それに応じて濃度を上げて、ルシフェラーゼシグナルの大幅な増加を観察します。
7. HFFを事前に播種した96ウェルマイクロプレートから培地を慎重に吸引し、150 μLの寄生虫再懸濁液を3列5行の形式でウェルに接種します。これは3つの技術的反復と5つの時点に相当します。
8. マイクロプレートを37°Cおよび5%CO₂で4時間インキュベートします。
9. ウェルから培地を慎重に吸引して侵入していない寄生虫を除去し、各列(最初の列を除く)にRTフェノールレッドフリー培地をウェルに充填します。
10. 等量のPBSと2倍ルシフェラーゼアッセイバッファーを混合し、ルシフェラーゼ基質を12.5 μMに希釈します。
11. 100 μLの希薄ルシフェラーゼ基質を上段の各ウェルに加えます。マイクロプレートを室温で10分間インキュベートし、細胞が完全に溶解するまで待ちます。
12. マイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を測定します。プレートリーダーの設定を表1に示します。各読み取り値は、感染後4時間で侵入した寄生虫の初期数を表しています。
13. 各行に対して手順1.9〜1.12を24時間ごとに4日間繰り返し、媒体を変更せずに繰り返します。これらの測定値は、感染後24時間、48時間、72時間、および96時間における複製された寄生虫の総数を反映しています。
14. 各時点の平均測定値を計算し、それらを4時間での平均測定値で割って、時間の経過に伴う寄生虫の成長の倍率変化を決定します。
15. グラフ作成ソフトウェアを使用してデータをプロットします。
16. 倍加時間を計算するには、インキュベーション時間にわたる個々の時点における倍率変化のlog2値をプロットします。線形回帰関数を使用して、各ひずみの倍加時間を表す傾きを計算します。

表1:ルシフェラーゼベースのトキソプラズマ増殖アッセイ中のルシフェラーゼ活性測定のためのマイクロプレートリーダー設定

名

ルシフェラーゼ：	エンドポイント
統合時間:	1秒
フィルターセット - エミッション:	フルライト
光学：	ページのトップへ
得：	135
読み取り速度:	正常
遅延：	100ミリ秒
読み取り高さ:	4.5ミリメートル

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Biotek Synergy H1 ハイブリッド マルチモード マイクロプレート リーダー	BioTekインストゥメント
セレンテラジンh	プロルーム	301-10 hCTZの
ソフトウェア
GraphPad Prismソフトウェア(第8版)