寄生虫に対する抗寄生虫薬品の有効性を研究するためのルシフェラーゼアッセイ

要約

出典:Key、M.、他 ルシフェラーゼベースの成長アッセイを使用した細胞内トキソプラズマゴンディ増殖に対する化学阻害剤効率の決定。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは、細胞内病原体であるトキソプラズマ原虫に対する抗寄生虫化学阻害剤の有効性を決定するために使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。この研究では、ルシフェラーゼを発現する寄生虫が宿主細胞に侵入して複製し、生存します。この化学阻害剤は、寄生虫のシステインプロテアーゼと結合し、複製を阻害します。検出されるルシフェラーゼ活性は、寄生虫増殖の倍率変化に比例し、寄生虫に対する薬物の有効性を決定します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. トキソプラズマの増殖に対する化合物阻害効果の評価

>注:ここでは、トキソプラズマの成長におけるLHVSの阻害の評価を例として提示します。8つの異なる濃度のLHVSを試験し、RHΔku80::NLuc株およびRHΔku80Δcpl::NLuc株の両方について、3つの生物学的反復のそれぞれに対して3つの技術的反復を行います。

1. 寄生虫に感染する前に、HFFを96ウェルマイクロプレートに3行9列の形式で播種し、1株あたりの化合物につき1回の生物学的複製を行います。宿主細胞は、使用前に少なくとも7日間増殖させます。
2. RHΔku80::NLuc および RHΔku80Δcpl::NLuc 寄生虫を 2 日前に通過
させてください。
3. 使用の2日前に、~0.3-0.4 mLの完全に溶解した寄生虫をT25フラスコに移すことにより、トキソプラズマ寄生虫をコンフルエントHFFに流します。感染した宿主細胞を5%_CO2とともに37°Cで2日間インキュベートします。
4. 溶解したばかりの寄生虫5 mLを21 Gの安全針5倍に通して細胞内寄生虫を遊離させ、3 μmフィルターに通して宿主細胞の破片を除去します。7 mLのフェノールレッドフリーD10培地を使用してフラスコから残留寄生虫を洗い流し、再度フィルターを通過します。
5. 寄生虫を1000 x gで室温(RT)で10分間遠心分離します。上清を注ぎ、ペレットを10mLのフェノールレッドフリーD10培地に再懸濁します。
6. 血球計算盤を使用して寄生虫をカウントし、濃度を決定します。
7. 野生型(WT)株については、寄生虫を1 x 10⁴寄生虫/mLに希釈します。成長不全の寄生虫株については、それに応じて濃度を上げて、ルシフェラーゼシグナルの大幅な増加を観察します。
8. 寄生虫をフェノールレッドフリー培地に1 x 10⁴寄生虫/mLで再懸濁します。
9. コンフルエントHFFを含むプレートから培地を吸引し、各ウェルに150 μLの寄生虫再懸濁液を接種します。マイクロプレートを37°Cおよび5%CO₂で4時間インキュベートします。
10. LHVSは、12ウェルリザーバーで8種類の濃度で段階希釈により調製します。一般に、濃度は段階希釈法で3倍に減少します.
    手記： 最低濃度は、最高濃度に比べて 6,561 倍減少します。希釈の倍率変化は、個々の化合物のさまざまな特性に基づいてそれに応じて調整できます。
11. 感染後4時間で、培地を吸引して侵入していない寄生虫を除去し、カラム2〜9の各ウェルに、異なる濃度のLHVSを添加した150μLの培地を充填します。最初のカラムを通常の培地で満たしたままにして、未処理のコントロールとして使用します。
12. マイクロプレートを37°Cおよび5%CO₂でさらに96時間インキュベー
トします。
13. ウェルから培地を慎重に吸引して侵入していない寄生虫を除去し、各列(最初の列を除く)にRTフェノールレッドフリー培地をウェルに充填します。
14. 等量のPBSと2倍ルシフェラーゼアッセイバッファーを混合し、ルシフェラーゼ基質を12.5 μMに希釈します。
15. 100 μLの希薄ルシフェラーゼ基質を上段の各ウェルに加えます。マイクロプレートを室温で10分間インキュベートし、細胞が完全に溶解するまで待ちます。
16. 個々のウェルのルシフェラーゼ活性を測定します。
17. 個々のLHVS濃度のウェルからの3つの技術的複製のルシフェラーゼ活性を平均
化します。
18. 各LHVS濃度の平均ルシフェラーゼ活性を未処理の寄生虫に由来する平均ルシフェラーゼ活性で割って、正規化されたルシフェラーゼ活性をパーセンテージとして計算します。
19. グラフ作成ソフトウェアを使用して、個々のLHVS濃度に対する正規化されたルシフェラーゼ活性をプロットします(図1)。寄生虫の増殖に対するピリメタミンの阻害も対照として測定されます。ピリメタミンは、トキソプラズマの葉酸代謝を阻害することにより、急性トキソプラズマ症を治療するために使用される臨床抗生物質です。
20. グラフ作成ソフトウェアに埋め込まれた方法を使用して、個々の化合物のIC₅₀値を計算します。「用量反応阻害」回帰プログラムの下で、正規化された応答対[阻害剤]。IC₅₀は、次の式を使用して計算されます:
    Y = 100/(1 + X/IC₅₀)
    ここで、Yは異なる濃度の阻害剤下での感染細胞の正常化されたルシフェラーゼ活性を表し、Xは個々の濃度の阻害剤を表します。

結果

図1:ルシフェラーゼベースの増殖アッセイを用いたLHVSおよびピリメタミンの阻害効果評価。寄生虫を96ウェルマイクロプレートに4時間接種して、宿主細胞への侵入を可能にしました。侵入していない寄生虫を洗い流し、プレートに異なる濃度のLHVSまたはピリメタミンを含む培地を充填し、さらに96時間インキュベートしてから、ルシフェラーゼ活性を測定しました。個々の阻害剤濃度で処理された寄生虫の測定されたルシフェラーゼ測定値は、未処理の寄生虫から検出されたシグナルに対して正規化されました。データをグラフ化プログラムにプロットし、IC₅₀決定のための回帰分析を行いました。アッセイは、3回の生物学的レプリケートで、それぞれ3回のテクニカルレプリケートで繰り返しました。データは平均±SEM、n = 3生物学的複製を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Biotek Synergy H1 ハイブリッド マルチモード マイクロプレート リーダー	BioTekインストゥメント
セレンテラジンh	プロルーム	301-10 hCTZの
ソフトウェア
GraphPad Prismソフトウェア(第8版)