寄生虫の薬物誘発性細胞毒性を評価するためのβ-ガラクトシダーゼアッセイ

要約

出典:Alonso, V. L. et al.In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、β-ガラクトシダーゼ酵素を発現する寄生虫Trypanosoma cruziに対するトリパノシダ薬の細胞毒性能を決定するための簡単で堅牢な方法について説明します。β-ガラクトシダーゼは細胞溶解の指標として機能し、その活性は薬の効果を評価するために使用できます。

プロトコル

1. β-ガラクトシダーゼアッセイ

>注:β-ガラクトシダーゼ活性の定量は、寄生虫の数を決定する間接的な方法として使用されます。トリパノシダーゼ化合物の存在下では増殖が阻害され、未処理の対照と比較して寄生虫の数が少なくなり、これがβガラクトシダーゼ活性の低下、したがって吸光度の低下に反映されることが予想されます。

1. 寄生虫をBZNでインキュベートします
   1. 1ウェルあたり対応する2倍ベンズニダゾール(BZN)溶液100 μLを添加すると、最終濃度のBZNが80、40、20、10、5、および2.5 μMになり、100 μLのエピマスティゴート懸濁液、アマスチゴテスを有するVero細胞(感染後2日)、または96ウェルプレート内のトリポマスティゴテスが得られます。
   2. エピマスティゴテスを28°Cで72時間インキュベートし、トリポマスティゴテスまたは感染したベロ細胞をアマスチゴテスと24時間、37°Cおよび5%CO₂.
      インキュベートします。 手記：各薬物濃度は、少なくともトリプリケートで評価し、エピマチゴテス、トリポマスティゴテス、およびジメチルスルホキシド(DMSO)に感染したベロ細胞の対照培養物を含める必要があります。.
2. 比色反応
   1. 治療インキュベーション期間後、感染したベロ細胞またはトリポマスティゴテがフェノールレッドを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)にある場合は、干渉を避けるために培地を100μLの1x PBSと交換してください。対応する培地(または必要に応じて1x PBS)のみを含有するブランクウェルを3回
      手記：フェノールレッドを含まないLIT培地やDMEMの場合、上腹部用の培地を取り除く必要はありません。フェノールレッドのDMEMは引き続き使用できます。DMEMのみでブランクウェルを調製して塩基吸光度を測定し、データ解析中にこの値を減算します。無色のシュナイダーの昆虫培地は、エピマスティゴテスの代替品です。
   2. 40 μL のクロロフェノール赤色 β-D-ガラクトピラノシド (CPRG) 基質溶液と 10 μL の界面活性剤溶液を各ウェルに加え、最終濃度 200 μM CPRG と 0.1% 界面活性剤を各ウェルの最終容量 250 μL で得ます。
      手記： CPRG溶液と界面活性剤は、ウェルあたり50μLの最終容量で一緒に添加できます。
   3. 37°Cで2時間インキュベートし、マイクロプレート分光光度計で595nmの吸光度を測定します.
      手記：予想される色の変化は、β-ガラクトシダーゼ酵素の切断時に黄色から赤褐色になります(図1A)。インキュベーション時間は最大4時間まで延長でき、クロロフェノールレッドの吸光度スペクトルは、同様のカーブフィッティングで570〜595nmで読み取ることができます。CPRG基質の存在下で最大24時間のインキュベーションでは、同様のカーブフィッティングが示されています。

結果

図1:エピマチゴート型Dm28cのベンズニダゾールのIC50値の計算。 (A)CPRGを添加する前(1)、CPRGと界面活性剤を最初に添加した後(2)、およびCPRGと界面活性剤とのインキュベーション後(3)に異なるBZN濃度(2.5、5、10、20、40、および80μM)で処理した縮周乳房を含む96ウェルプレート。(B)Dm28c / pLacZエピマスタトートの595nmでのBZN対吸光度(OD)の対数濃度のXYプロット。プロットは、IC50値を推定するために非線形回帰を使用して適合されました。各値は、6 つの独立した生物学的反復の平均と標準偏差 (エラーバー) を表します。連続した青い線は、カーブの適合を表します。略語:CPRG =クロロフェノール赤β-D-ガラクトピラノシド;BZN =ベンズニダゾール;OD = 光学密度...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	コーニング	3599
ベンズニダゾール	シグマ・アルドリッチ	419656
5 mL 血清学的ピペット滅菌	ジェットバイオフィル	GSP010005
10 mL血清学的ピペット滅菌	ジェットバイオフィル	GSP211010
バイオセーフティキャビネット	テルスター	バイオII A/P
CPRGの	ロシュ	10 884308001	クロロフェノール Red-β-D-ガラクトピラノシド
DMEM、高グルコース	サーモフィッシャー シエンティフィック	12100046	粉
DMSOの	シントオルガン	SIN-061	ジメチルスルホキシド
子牛胎児血清	インターネゴシオスSA	FCSのFRA 500	滅菌および熱不活化
ベロ細胞	ATCCの	CRL-1587
マイクロプレート分光光度計	ビオテック	シナジーHTX
マイクロ遠心チューブ 1.5 mL	ターソン	500010-N
G418二硫酸塩溶液	ロシュ	G418-RO	ストック濃度:50 mg/mL

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