試験薬物曝露時の脳切片からのモノアミン放出を測定するためのプレートベースアッセイ

要約

出典:Pino, J. A. et al. 急性脳切片における内因性モノアミン放出を測定するためのプレートベースのアッセイ。J. Vis. Exp. (2021年)

このビデオでは、代謝的に活性なex vivoラット脳スライスのニューロンからのモノアミン放出メカニズムを試験薬で処理した場合に、モノアミン放出メカニズムを調査するアッセイを実演しています。このアッセイは、神経刺激薬が細胞性モノアミントランスポーターを介してモノアミン放出を誘導するのに対し、KCl濃度が高いとシナプス小胞エキソサイトーシスを介した小胞モノアミン放出が誘導されることを示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳スライスまたはパンチからの生体外内因性モノアミン放出

>注:このセクションで使用されるデバイスは、48ウェルプレートと、カルボゲンラインに接続されたインセットフィルターのない6つの微量遠心分離フィルターユニットで作られた組織ホルダーで構成されています(図1)。ホルダーを作るには、頑丈なプラスチックロッド(セルスクレーパーなど)を使用し、はめ込みフィルターなしで微量遠心分離機のフィルターユニットを瞬間接着剤で接着します。1〜2日間乾燥させます。内因性モノアミン放出実験に必要な時間と、アンフェタミン、フルオキセチン、コカインの濃度は、現在の文献と以前のプロトコルに基づいています。

1. 組織の活性化
   1. 脳組織を排出チャンバーの各ウェルに移し、0.5〜1 mLの酸素化排出バッファーのスライドウォーマーで37°Cで30〜50分間回復させます(図1B1)。
   2. このインキュベーション中に、薬物を実験に必要な濃度に希釈します。すべての薬物は排出緩衝液に溶解する必要があり、濃度は現在の文献に基づいています。
2. 最初のインキュベーション
   1. 脳組織を含む組織ホルダーを500 μLの酸素化排出バッファーを含むウェルに移し、37 °Cで20分間インキュベートします。バッファーが輸送されないか、バッファーがまったくないことを確認します。ホルダーに過剰なバッファーがなくなるまで、ウェルの端にあるホルダーを軽くたたいて、バッファーが輸送されないことを確認します。
   2. モノアミントランスポーター阻害剤などの薬理学的薬剤を用いた実験では、酸素化排出緩衝液(例:10 μM フルオキセチン、40 μM コカイン、図 1B2 を参照)で希釈した薬物と組織サンプルをインキュベートします。各ウェルの最終容量は500μLです。
3. 2回目のインキュベーション
   1. 組織と一緒にホルダーを、各薬物の所望の濃度の有無にかかわらず、500 μLの総排出緩衝液を含む新しいウェルセットに移動します。余分なバッファが残っていないことを確認します。各ウェルは、実験条件の n= 1 を表します。各実験条件はトリプリケートで実行されます。
   2. 1つのウェルには酸素化排出バッファーが含まれ、次のウェルには10〜30μMのAMPHが含まれ、最後のウェルには10〜30μMのAMPHとモノアミントランスポーター阻害剤が含まれます。各薬物は酸素化排出緩衝液に溶解されます。
   3. 組織を37°Cで20分間インキュベートし、500μLの薬物状態で培養します。
      手記：追加のウェルには、モノアミントランスポーター阻害剤の有無にかかわらず、酸素化された高K+排出緩衝液が含まれていてもよい。各薬物を酸素化排出緩衝液(500μL)に溶解します。
   4. この2回目のインキュベーション(20分)の間に、ステップ1.2.1の最初のインキュベーションで得た溶液をウェルから回収し、1 Nの過塩素酸またはリン酸(HPLCの種類による、最終濃度0.1 N)を50 μL含む微量遠心チューブに移します。サンプルの最終容量は550μLです.氷上に微量遠心チューブを維持し、チューブ#1にラベルを付けます。
   5. 20分の2回目のインキュベーション後、脳切片またはパンチのあるティッシュホルダーを空のウェルに移動し、プレートを氷上に維持します。上清を、1 Nの過塩素酸またはリン酸を50 μL入った微量遠心チューブに移します。サンプルの最終容量は550μLです.氷上に微量遠心チューブを維持し、チューブ#2にラベルを付けます。
   6. 1 mLの氷冷解剖バッファーを、組織を含む各ウェルに加えます。小さなピンセットを使用してすべての組織を採取し、清潔な微量遠心チューブに移します。
   7. 脳組織のチューブを-80°Cに保持し、1mLの解剖バッファーを廃棄します(図1B4)。
   8. 各インキュベーションで得られた溶液を、微量遠心分離機用フィルターチューブ(0.22 μm)で2,500 x gで2分間、ろ過液を使用して、電気化学的検出を備えたHPLCを使用してモノアミン含有量を測定します(図1B5)。

結果

図1:エフラックス実験の実験装置。(A)排出チャンバーは、48ウェルの組織培養プレートと、カルボゲンラインに接続された組織ホルダートレイで構成されています。(B)組織活性化(B1)、モノアミントランスポーター阻害剤の有無(B2)、排出実験(B3)、最終試料処理(B4-B5)を示す内在性モノアミン排出実験の実験設計図を示す図です.(C)左側のパネルは、自動注入の準備のために灌流液をHPLCにロードする実験者を示しています。右側のパネルは、モノアミン標準試料のピークを示す代表的なクロマトグラムを示しています。曲線下面積(AUC)は、モノアミン標準試料と脳サンプルごとに測定されます。キャリブレーション後、各脳サンプルで測定されたAUC...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
48ウェルプレート	NAの	NAの	試験
無水塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C1016	改良型人工脳脊髄液OR排出緩衝液
D-(+)-グルコース	シグマ	1002608421	解剖バッファー
L-アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A5960	解剖バッファー
硫酸マグネシウム	シグマ	7487-88-9	KHバッファ
微量遠心分離機用フィルターユニット UltraFree	ミリポア	C7554	アッセイ - 6 で 48 ウェルプレートに適合
パージリンクロロハイドレート	シグマ・アルドリッチ	P8013	改良型人工脳脊髄液OR排出緩衝液
塩化カリウム	シグマ	12636	KHバッファ
リン酸カリウム一塩基性	シグマ	1001655559	KHバッファ
炭酸水素ナトリウム	シグマ	S5761	解剖バッファー
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761	解剖バッファー
塩化ナトリウム	シグマ	S3014	KHバッファ

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