大動脈弁間質細胞のカルシウム濃度を測定するための石灰化アッセイ

要約

出典:Bouchareb, R. et al., Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro.J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオは、大動脈弁間質細胞の石灰化をin vitroで評価するためのアッセイ技術を示しています。このアッセイは、カルシウムイオンと反応して紫色のカルシウム-ヒ素体を形成するカルシウム感受性色素であるアルセナゾIII試薬を使用してカルシウム濃度を定量するのに役立ちます。

プロトコル

ここに記載されているすべての動物の手順は、マウントサイナイのアイカーン医科大学の施設中核および使用委員会によって承認されています。

1. 成体マウスからの弁細胞単離前の調製

1. 図1Aに示すすべての手術器具を70%v/vエタノールを使用して洗浄および滅菌し、その後30分間オートクレーブします。
2. 500 μLのペニシリン-ストレプトマイシンを50 mLの10 mm HEPESに加えます。50 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のアリコートを調製します。溶液を氷の上に保ちます。
3. 1 mg/mL および 4.5 mg/mL のコラゲナーゼ溶液を調製し、各溶液 5 mL を 15 mL チューブで使用して、すべての手順を実行します。5 mLの1 mg/mLコラゲナーゼを調製するには、5 mgのコラゲナーゼを2.5 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM、ウシ胎児血清(FBS)フリー)および抗生物質(ステップ1.2の1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加した2.5 mLの10 mM HEPESを混合します。0.22μmフィルターで溶液をろ過し、汚染を除去します.
   注:酵素を保護するために、溶液を氷上に保管してください。
4. 以下に説明するすべての手順で使用する前に、DMEM溶液を37°Cに温めてください。DMEMに1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、5mLの200 mM L-グルタミン、1mLのマイコプラズマ除去試薬(材料の表を参照)、および10%FBSを補給して、完全な培地を調製します。

2. 弁細胞の分離

1. 実験用に10個の⁵細胞を取得するには、8週齢のマウスを5匹(最低3匹)使用します。マウスを1 mLのイソフルランに浸した小さなティッシュペーパーと一緒に誘導チャンバーに入れますが、組織に触れないようにしてください。動物が完全に麻酔をかけられていることを確認するため。つま先のつま先つまみ反射を確認し、頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。イソフルランを使用して、以下に説明する手順が末期であるため、頸部脱臼の前に痛みを軽減します。.
2. マウスを解剖プラットフォームに置き、前足をカニューレで固定して所定の位置に保持します。胸部と腹部をエタノールで洗浄します。腹部と胸部をハサミで開きます。小さな手術用ハサミで、左心房と左心室の間を切開してマウスを放血します。10mLの冷たい1x PBSで心臓を灌流し、心臓から血液を取り除きます。
3. 心臓を切断し、図1Bに示すように、上行大動脈から3mm離します。実体顕微鏡で大動脈弁を解剖します。心室の中央で心臓を水平に切断します(図1C)。左心室を大動脈に向かって切断し、大動脈弁を慎重に解剖します(図1D-F)。35 mmの小さな組織培養皿にバルブをプールします。
4. 75 mmの細胞培養皿で分離したバルブを、抗生物質(1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加した5 mLの冷たいHEPES(10 mM)で洗浄し、血液を除去します(図2)。上記のステップ1.3.
   で説明したように、コラゲナーゼ1 mg/mLおよび4.5 mg/mLの15 mLチューブ2本を調製します 手記：解剖後、無菌のバイオセーフティフード内の分離されたバルブを操作して、汚染を最小限に抑えます。
5. コラゲナーゼI型(1 mg/mL)でバルブを37°Cで30分間インキュベートし、連続振とうします(図2)。チューブを150 × gで5分間遠心分離し、ペレットを2 mLのHEPES(10 mM)で1回洗浄し、高速で30秒間ボルテックスします。このチューブの内容物を35 mmの培養皿に注ぎ、細いピンセットを使用して組織の断片を新しいチューブに慎重に移します
   手記：この段階では、VICはまだ組織から解離しておらず、ペレットには組織片が含まれています。内皮細胞による汚染を避けるため、ステップ2.5でボルテックスした後は遠心分離しないでください。
6. ペレットを15 mLチューブに入れ、5 mLのコラゲナーゼI型(4.5 mg/mL)を37 °Cで35分間連続撹拌しながらインキュベートします。1 mLピペットで細胞を再懸濁して細胞を分離し、150 × gで4 °Cで5分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、ペレットを2 mLの完全DMEMに再懸濁します。150 × gで4°Cで5分間遠心分離し、この手順を2回繰り返して細胞を洗浄します
   手記：ペレットにはまだいくつかの組織片があります。
8. ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁し、6ウェル細胞培養皿の1ウェルに細胞を最小限の培地でプレートして、培養皿への付着を促進します。細胞をそのまま、5%の二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターに入れます。
9. 3日後、顕微鏡で細胞をチェックして、組織の破片の近くで良好な成長を確認します。顕微鏡で1,000個の細胞が見えたら、オートクレーブピンセットで組織破片を慎重に取り除き、培地を交換します.
   手記：プレートを乱してはいけません。必要な数の細胞が観察されない場合は、細胞培養皿をさらに2日間インキュベーターに戻します。
10. 細胞が70%コンフルエント(2.5 × 10⁵)の場合、トリプシン処理してから75 mmの組織培養皿に移します。

3. in vitro石灰化アッセイ

1. フードを70%エタノールで洗浄し、DMEM培地を37°Cに温めます。
2. 100,000細胞/コンディショニングを完全DMEMで6ウェルプレートに播種し、37°Cで24時間培養します。
3. 2 mM の NaH₂PO₄、10-7 M インスリン、および 50 μg/mL のアスコルビン酸を DMEM で 5% FBS と混合して、石灰化培地を調製します。DMEM93mLに対して、FBS5mL、抗生物質1mL(最終濃度1%)、ピルビン酸ナトリウム1mL(100mM)、NaH2PO427.5mg、インスリン5.8μL、アスコルビン酸5mgを加えます<br/> 注:使用前に0.22μmフィルターを使用して溶液をろ過してください。
4. 24 時間後、上清培地を石灰化培地と交換します。細胞を37°Cで7日間インキュベートします。3日目に、新鮮な石灰化培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻して7日間の治療を完了します。
5. 7日後、培地を取り出し、1x PBSの2mLで細胞を2回洗浄します。細胞を0.6 N塩酸(HCl)1 mLで37°Cで24時間インキュベートし、HClを1.5 mLチューブに集め、ロータリーエバポレーターで蒸発させます。すべてのチューブの内容物を60 μLのHCl.
   に再懸濁します。 手記：乾燥手順は、溶液を濃縮し、各条件で同じ容量にすることが重要です。
6. すぐに使用できるキットで入手可能なArsenazo III試薬を使用してカルシウム濃度を測定するには、96ウェルプレートを使用してください(詳細については、材料の表を参照してください)。
7. 10 mg / dL濃度のカルシウム標準液を準備します。10 mgの水酸化カルシウム(Ca(OH)₂)を秤量し、100 mLの蒸留水に溶解します。
8. 透明な96ウェルプレートで、2μLのブランク溶液(HCl、0.6 N)、標準溶液、ウェルあたりのサンプル(10 mg / dL)、およびサンプルをピペットします。実験を3回に分けて行い、ピペッティングのばらつきを確認します。各条件に200μLの試薬を加えます.
   手記：15 mg/dL を超えるサンプルは、生理食塩水で 1:1 に希釈し、再分析し、結果に 2 を掛けます。
9. 室温で15分間反応をインキュベートします.
   手記：反応は60分間安定です。
10. 650nmでのプレートの吸光度を読み取り、記録します。次の式を使用して、サンプル中のカルシウムの量を計算します:
    カルシウム(mg / mL)=(サンプルの吸光度/標準の吸光度)×標準の濃度

結果

図1:バルブ解剖の説明。(A)解剖に必要なすべての手術器具の代表画像で、マウスの皮膚を開くにはハサミ2、胸部を開くにはハサミ3が必要となる。ピンセット5と6は、皮膚を保持して胸を開くために必要です。(B)大動脈から3mmの組織を残します(黒矢印)。(C)ハサミ番号4で心室の真ん中で心臓を切断します。(D)ハサミで大動脈弁に向かって心臓を開きます3。細いピンセット7と8を使用して、大動脈弁を慎重に解剖します。弁は見え、マウスの弁組織(青い矢印)の特徴であるいくつかの黒い点があります。(E)大動脈弁をよりよく視覚化するために倍率を上げます。小さなはさみ4でバルブを分離します。(F)ピンセット7で組織...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3mm刃ハサミ	F.S.T(エフエスティー)	15000-00
Arsenazo-III試薬セット	ポイントサイエンティフィック	C7529-500	カルシウムの濃度を測定するキットです
ボンはさみ	F.S.T(エフエスティー)	14184から09
水酸化カルシウム	シグマ -アルドリッチ	31219
コラゲナーゼI型(125ユニット/ mg)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17018029
DMEM	テルモフィッシャー	11965092
極細グレーフ鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11150から10
FBSの	ギブコ	16000044
細い鉗子	F.S.T.デュモン
HCl	シグマ・アルドリッチ	H1758 さん
HEPES 1 Mソリューション	STEMCELLSテクノロジー
L-グルタミン 100x	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A2916801
PBSの10倍	シグマ・アルドリッチ
ペニシリンストレプトマイシン100x	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10378016
ピルビン酸ナトリウム100 mM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360070
標準パターン鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11000から12
外科用ハサミ - シャープ-ブラント	F.S.T(エフエスティー)	14008から14
トリプシン0.05%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25300054

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