魚の胚におけるPM2.5媒介性DNA損傷を検出するための免疫蛍光アッセイ

要約

出典:Huang, Y., et al.免疫蛍光法を使用して、ゼブラフィッシュの胚の心臓における_PM2.5誘発DNA損傷を検出します。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオは、ゼブラフィッシュの胚の心臓におけるPM_2.5による酸化的損傷を検出するための高感度免疫蛍光法に基づくアッセイを、DNA損傷と二本鎖DNA切断を示す8-OHdGとγH2AXのレベルを測定する方法を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. PM_2.5サンプリングと有機化合物抽出

>注:_PM2.5は、前述のように、2015年8月1日から7日にかけて中国の蘇州の都市部で収集されました。

1. 47 mmの石英メンブレンフィルターを500°Cのマッフル炉で2時間焼き、有機成分を取り除きます。
2. PM_2.5サンプラーにフィルターを配置して、24時間中断することなくサンプリングします。
3. フィルターを取り外し、室温で24時間乾燥させます。
4. 分析天びんを使用してフィルターを定量化します。
5. ジクロロメタンを溶媒としてソックスレー抽出することにより、フィルターから有機成分を抽出します。
6. 60°Cのウォーターバスと窒素の流れでロータリー蒸発させることにより、EOMを乾燥させます。EOMをDMSOに溶解し、-20°Cで保存します。

2. ゼブラフィッシュの胚の採取と治療

1. ゼブラフィッシュを28.5°C±0.5°Cに維持し、14時間の光と10時間の暗光周期サイクルを持つ再循環養殖システムを使用します。
2. 健康な成魚の成魚を、オスとメスの比率が2:1の水槽に入れます。
3. 翌日、胚を採取し、システム水(ゼブラフィッシュの繁殖水)で洗います。
4. 正常な発生(サイズが均一で、粒が完全で、卵の凝固がない)を示すゼブラフィッシュの胚を、直径7cmの個々のガラスシャーレ(ディッシュあたり約50個の胚)で4つのグループに選択し、ランダムに分けます。
5. NACの存在下または非存在下で、2 hpfから72 hpfまで0.25 μMで胚をPM_2.5(5 mg / L)で処理します。DMSOを車両制御として使用し、最終濃度を0.1%(v/v)にします。

3. ゼブラフィッシュ胚の形態観察と心臓解剖

1. 72 hpfで、胚をスライドガラスに移し、実体顕微鏡で観察します。心膜浮腫、ループの変化、サイズの減少などの心臓の奇形を記録します。
2. 奇形率(生きている全胚のうち心臓に欠陥のある胚の割合)を計算し、一元配置分散分析とそれに続くトルコの多重比較検定(p < 0.05 =統計的に有意)を使用してグループ間の違いを分析します。
3. 0.6 mg/mL MS-222 で胚を麻酔し、スライドガラス上に固定します。
4. ImageJソフトウェアを使用して、30秒間の心拍を記録し、心拍数を定量化します。
5. ゼブラフィッシュの胚から心臓を、実体顕微鏡下で使い捨ての注射針で解剖します。注意:ハートの形を壊さないでください。

4. 免疫蛍光アッセイ

1. 免疫蛍光アッセイを使用してゼブラフィッシュの胚の中心部にPM_2.5によって誘発されるDNA損傷を検出するには、疎水性バリアペンを使用して、きれいなガラス面に円を描きます。
2. 4%パラホルムアルデヒド50 μLをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1.25 mLに加えて、固定液を調製します。
3. 切片した3つの心臓を1つの疎水性バリアペンサークルに入れ、室温で20分間インキュベー
トします。
4. 顕微鏡下で溶液をデカントし、サンプルを室温で少なくとも5分間乾燥させて、心臓がスライドガラスに完全に付着するようにします。
5. スライドを PBS で 0.1% Tween 20 (PBST) を使用して 3 回、1 回の洗浄につき 5 分間洗浄します。
6. 50 μL のウシ血清アルブミン (BSA) を 1000 μL の PBST に添加して 5% BSA 溶液を取得し、スライドを湿潤チャンバー内で 1 時間インキュベートして非特異的抗体の結合をブロックします。
7. 溶液をデカンタントし、サンプルをPBSTで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。
8. 8-OHdGに対するマウスモノクローナル抗体2 μLおよびγH2AXに対するウサギポリクローナル抗体2 μLを296 μLのPBSTで希釈して、有効な一次抗体カクテル溶液を得ます。
9. 心臓サンプルを、8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体カクテル溶液50 μLと加湿チャンバー内で、室温で少なくとも1時間、または4°Cで一晩インキュベートします(一晩インキュベートするとシグナル強度が増加する可能性があります)。
10. 溶液をデカンタントし、サンプルをPBSTで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。
11. FITC標識ヤギ抗マウス二次抗体1 μLおよびcy3ヤギ抗ウサギ二次抗体1 μLを498 μLのPBSTで希釈して、有効な二次抗体カクテル溶液を取得し、サンプルを二次抗体(PBSTで1:500)と室温の暗所で1時間インキュベートします。
12. 溶液をデカンタントし、サンプルをPBSで3回洗浄し、光から保護された洗浄ごとに5分間洗浄します。
13. 20 μLのDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)をサンプルに加え、室温で30分間核染色します。
14. カバースリップを貼ってスライドさせ、マニキュアで密封して乾燥や動きを防ぎます。次に、蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングし、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSOコントロールサンプルの平均で相対的な変化を計算します。ステップ 3.2 のように、データの統計的有意性を判定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
8-OHdG 抗体	サンタクルーズバイオテクノロジー、米国	SC-66036	一次抗体
分析天びん	ザルトリウス(中国)	BSA124S
BSAの	Solarbio、北京、中国	SW3015	ブロッキング用
ダピ	Abcam, アメリカ	ab104139	核対比染色用。
DMSOの	Solarbio、北京、中国	D8371
蛍光顕微鏡	オリンパス(日本)	IX73	蛍光シグナルのイメージング用
ヤギ抗ウサギIgG Cy3	カールスバッド、アメリカ	CW0159	二次抗体
ヤギ抗ウサギIgG FITC	カールスバッド、アメリカ	RS0003	二次抗体
N-アセチル-L-システイン(NAC)	Adamas-Beta、上海、中国	616-91-1
オービタルシェーカー	キリンバイアー、中国	TS-1
パラホルムアルデヒド	シグマ、中国	P6148	固定のために4%パラホルムアルデヒドを作ります。
リン酸緩衝生理食塩水	HyClone,アメリカ	01 SH30256月	0.1% Tween in PBSで洗浄します。
PM2.5サンプラー	TianHong、武漢、中国	TH-150Cの	24時間中断のないPM2.5サンプリング用。
再循環型養殖システム	HaiSheng、上海、中国		ゼブラフィッシュはその中で維持されていました。
ソックスレー抽出器	ZhengQiao、上海、中国	BSXT-02	有機成分抽出用。
実体顕微鏡	ニコン、カナダ	SMZ645	ゼブラフィッシュの胚からの心臓解剖用。
トリカインメタンスルホン酸(MS222)	シグマ、中国	E10521	ゼブラフィッシュの胚に麻酔をかける
トゥイーン 20	シグマ、中国	P1379
γH2AX 抗体	Abcam, アメリカ	AB26350	一次抗体

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