てんかん様活動を記録するための脳波記録法

要約

出典:Carvalho, M. et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、電気生理学またはEEGセットアップを使用して、鼻皮質-海馬の器官型スライスのてんかん様活動をex vivoで記録する技術について説明しています。これは、てんかん発生の動態と進行を研究し、てんかんを治療するための潜在的な治療標的をスクリーニングするのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 鼻皮質-海馬スライスの準備

>注:鼻皮質-海馬スライスの調製には、P6-7 Sprague-Dawleyラットを使用します。

1. 培養セットアップと培地調製
   1. 培養の前日に、必要な培地を準備し、4°Cに置きます。
   2. 解剖培地を調製します:Gey's Balanced Salt Solution(GBSS)中の25 mMグルコース。
   3. 培地を調製する:50% Opti-MEM、25% HBSS、25% ウマ血清 (HS)、25 mM グルコース、30 μg/mL ゲンタマイシン。
   4. 維持培地を調製します:Neurobasal-A(NBA)、2%B27、1 mM L-グルタミン、30 μg / mLゲンタマイシン、HS(15%、10%、5%、および0%)。.
2. ブレインハーベスティング
   1. 培養を開始する直前に、P1000ピペットで6ウェルプレートの各ウェルに1.1 mLの培地を加え、37°Cに置きます。
   2. すべての機器(解剖顕微鏡、ティッシュチョッパー、解剖ランプ、解剖ツール、電極、プレート、インサート、フィルターペーパー)を生物学的安全キャビネット内に置き、UV光の下で15分間滅菌します。
   3. スライスの厚さを350μmに調整します。
   4. GBSSを冷蔵庫から取り出します。6つのシャーレに5mLのGBSSを加えます。動物1匹につき6枚のシャーレが必要です。
   5. ネズミの子犬を安楽死させます。動物の脳幹の基部で鋭利なハサミを使用して斬首を行います。
   6. 動物の頭を冷たいGBSSで3回洗い、安全キャビネットに入れます。
3. 組織単離とスライスの調製
   1. 鋭い鉗子を眼窩にしっかりと挿入して頭を保持します。
   2. 細いハサミを使用して、椎骨孔から前頭葉に向かって正中線に沿って皮膚/頭皮を切り取り、脇に置きます。
   3. 同様に頭蓋骨を、大脳横裂(脳と小脳の間の空間)に沿って切断します。湾曲した長い鉗子で、離して動かします。
   4. 嗅球はへらで捨てます。脳を頭から取り出し、背側を上にして氷冷したGBSSに入れます(図1A)。
   5. 細い鉗子を小脳に挿入し、へらが各半球を非常に慎重に開くように正中線に沿って進みます(図1B)。
   6. 短い湾曲鉗子を使用して、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆っている余分な組織を慎重に取り除きます。次に、へらで、各海馬の下に切り込みます(図1C)。
   7. 片方の半球を手に取り、海馬を上に向けて濾紙の上に置きます。もう一方の半球で手順を繰り返し、最初の半球と平行に濾紙に入れます。半球をブレードに対して垂直にして、濾紙をティッシュチョッパーに置き、半球を350μmのスライスにカットします(図1D)。
   8. スライスした組織を冷たいGBSSを入れたシャーレに入れます(図1E)。
   9. 丸い先端電極を使用してスライスを慎重に分離します(図1F)。構造的に無傷の鼻皮質と海馬を持つスライスのみを保持します。DG領域とCA領域、および嗅内皮質と鼻周囲皮質を完全に定義する必要があります(図1G)。
   10. 各スライスをインサート(図1H-I)に、へらと丸い先端の電極を置きます。各スライスの周りの余分な解剖液をP20ピペットで取り除きます(図1J)。4つの鼻皮質-海馬切片を1つのインサートで培養できます(図1K)。
4. 文化の維持
   1. メディアは一日おきに交換してください。
   2. 培地を37°Cで温めます。
   3. インキュベーターからプレートを取ります。プラスチックの端を鉗子で保持して、各インサートを持ち上げます(図1L)。
   4. フリーハンドを使用して、ウェルから培地を吸引します。インサートをウェルに戻し、P1000ピペットで1 mLに温めた新鮮な培地を加えます(図1M)。すべてのインサートに対して繰り返します。メンブレンと媒体の間に気泡が挟まっていないことを確認してください.
      手記：てんかん様スライスは、培地中の血清の段階的かつ制御された剥奪を受けます。9 Days In Vitro (DIV) 以降、スライスは HS なしで NBA で維持されます。

2. 電気生理学的記録

>注:電気生理学的記録は、界面タイプのチャンバー内の7、14、および21 DIVの鼻皮質-海馬器官型スライスで行われました。録音はアンプで取得し、デジタル化し、ソフトウェアで分析しました。すべての録音はバンドパスフィルタリングされました(60Hzの8極ベッセルフィルターと600Hzのガウスフィルター

)。

1. セットアップの準備
   1. 50 mLのNBA培地と1 mLのB27、250 μLのL-グルタミンを調製します。37°Cでウォームアップします。
   2. 電気生理学のセットアップを閉回路に設定します。流量が2 mL/minかどうかを確認します。
   3. カーボックス(5%CO₂ / 95%O₂)バルブを開き、システム内の水位を確認します。
   4. 濾紙を界面記録室に入れて余分な媒体を排出し、レンズクリーニングペーパーをフレームの下に入れてスライスに媒体を供給します。
   5. 温度コントローラー、 amplifiers、およびマイクロマニピュレーター。
   6. インターフェースチャンバー内の温度を37°Cに安定させてから、録音を開始します。
   7. 人工脳脊髄液(aCSF:124 mM NaCl、3mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、10 mMグルコース、2 mM CaCl₂、1 mM MgSO₄、pH 7.4)を調製し、ガラス電極にシリンジを充填します。それを受電極に入れます。
2. 自発的な活動の記録
   1. 温度が安定したら、インキュベーターからプレートを取り外し、鋭利な刃でインサートから1スライスを切り取ります。それを60mmのプレートに入れ、中肉を一滴垂らします。インターフェース録音室に持っていきます。
   2. 海馬を右下にして、スライスをインターフェースチャンバーに配置します。受電極をCA3錐体細胞層に配置します。
   3. 連続取得プロトコルに進み、30分間記録します。

結果

図1:鼻皮質-海馬器官型スライスの調製に関する詳細な手順(A)脳を頭から取り出し、背側を上にして氷冷したGBSSに入れます。(B)鉗子を小脳に挿入します。正中線を通して脳を開き、海馬の上の余分な組織を取り除きます。(C)矢印で示されているように、海馬の下にヘラを切って。(D)両方の海馬を上向きにして平行に濾紙の上に置き、ティッシュチョッパーで350μmのスライスをカットします。(E)スライスした海馬を氷のように冷たいGBSSに入れます。(F)先端が丸いガラス電極を使用してスライスを分離します。(G)無傷の鼻皮質と海馬を描いたスライスのみを選択してください。(

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人工脳脊髄液(aCSF)			ホームメード
B-27™サプリメント(50X)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504-044
メスのハンドル用ブレード	ファインサイエンスツール	10011-00
ウシ血清アルブミン(BSA)	NZYTech	MB04602	5% BSAは、一次抗体を希釈するために使用されます。10mLのPBSに0.5gのBSAを加えます。
ブレイン/ティッシュスライスチャンバーシステム	ワーナー・インストゥルメンツ
細胞培養インサート、30 mm、親水性PTFE	ミリポアSAS	PICM03050
従来のインキュベーター	サーモサイエンティフィックヘレウス	BB15、ファンクションライン	37°C、CO2を5%に設定
ゲイの平衡塩溶液(GBSS)	バイオ産業	01-919-1A
ガラス電極	サイエンス製品	GB150F-10	ラウンドチップ自家製
インターフェースチャンバー	ワーナー・インストゥルメンツ	BSC-HT Haasトップ
アイリススパチュラカーブ	ファインサイエンスツール	10092-12
レンズクリーニングペーパー	ティフェン
L-グルタミン溶液 200 mM (Q)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25030-024
ティッシュチョッパー	The Mickle Laboratory Engineering Co., LTD.(ミックル研究所エンジニアリング株式会社)	MTC/2	350 μmに設定