ex vivoてんかんモデルにおける細胞死を評価するためのニューロン死アッセイ

要約

出典:Carvalho, M., et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、鼻皮質-海馬の器官型スライスにおけるニューロン死を評価する手法を示しています。ニューロン死は、in vivoてんかんに似た進行性のてんかん発作によって発生し、ヨウ化プロピジウムと免疫蛍光法を用いた死細胞の二重染色によって検出されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 鼻皮質-海馬スライスの準備

>注:鼻皮質-海馬スライスの調製には、P6-7 Sprague-Dawleyラットを使用します。

1. 培養セットアップと培地調製
   1. 培養の前日に、必要な培地を準備し、4°Cに置きます。
   2. 解剖培地を調製します:Gey's Balanced Salt Solution(GBSS)中の25 mMグルコース。
   3. 培地を調製する:50% Opti-MEM、25% HBSS、25% ウマ血清 (HS)、25 mM グルコース、30 μg/mL ゲンタマイシン。
   4. 維持培地を調製します:Neurobasal-A(NBA)、2%B27、1 mM L-グルタミン、30 μg / mLゲンタマイシン、HS(15%、10%、5%、および0%)。.
2. ブレインハーベスティング
   1. 培養を開始する直前に、P1000ピペットで6ウェルプレートの各ウェルに1.1 mLの培地を加え、37°Cに置きます。
   2. すべての機器(解剖顕微鏡、ティッシュチョッパー、解剖ランプ、解剖ツール、電極、プレート、インサート、フィルターペーパー)を生物学的安全キャビネット内に置き、UV光の下で15分間滅菌します。
   3. スライスの厚さを350μmに調整します。
   4. GBSSを冷蔵庫から取り出します。6つのシャーレに5mLのGBSSを加えます。動物1匹につき6枚のシャーレが必要です。
   5. ネズミの子犬を安楽死させます。動物の脳幹の基部で鋭利なハサミを使用して斬首を行います。
   6. 動物の頭を冷たいGBSSで3回洗い、安全キャビネットに入れます。
3. 組織単離とスライスの調製
   1. 鋭い鉗子を眼窩にしっかりと挿入して頭を保持します。
   2. 細いハサミを使用して、椎骨孔から前頭葉に向かって正中線に沿って皮膚/頭皮を切り取り、脇に置きます。
   3. 同様に頭蓋骨を、大脳横裂(脳と小脳の間の空間)に沿って切断します。湾曲した長い鉗子で、離して動かします。
   4. 嗅球はへらで捨てます。脳を頭から取り出し、背側を上にして氷冷したGBSSに入れます(図1A)。
   5. 細い鉗子を小脳に挿入し、へらが各半球を非常に慎重に開くように正中線に沿って進みます(図1B)。
   6. 短い湾曲鉗子を使用して、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆っている余分な組織を慎重に取り除きます。次に、へらで、各海馬の下に切り込みます(図1C)。
   7. 片方の半球を手に取り、海馬を上に向けて濾紙の上に置きます。もう一方の半球で手順を繰り返し、最初の半球と平行に濾紙に入れます。濾紙をティッシュチョッパーに置き、半球をブレードに対して垂直にし、半球を350μmのスライスにカットします(図1D)。
   8. スライスした組織を冷たいGBSSを入れたシャーレに入れます(図1E)。
   9. 丸い先端電極(図1F)を使用してスライスを慎重に分離します。構造的に無傷の鼻皮質と海馬を持つスライスのみを保持します。DG領域とCA領域、および嗅内皮質と鼻周囲皮質を完全に定義する必要があります(図1G)。
   10. 各スライスをインサート(図1H-I)に、へらと丸い先端の電極を置きます。各スライスの周りの余分な解剖用培地をP20ピペットで取り除きます(図1J)。4つの鼻皮質-海馬切片を1つのインサートで培養できます(図1K)。
4. 文化の維持
   1. メディアは一日おきに交換してください。
   2. 培地を37°Cで温めます。
   3. インキュベーターからプレートを取ります。プラスチックの端を鉗子で保持して、各インサートを持ち上げます(図1L)。
   4. フリーハンドを使用して、ウェルから培地を吸引します。インサートをウェルに戻し、P1000ピペットで1 mLに加温した新鮮な培地を加えます(図1M)。すべてのインサートに対して繰り返します。メンブレンと媒体の間に気泡が挟まっていないことを確認してください.
      手記：てんかん様スライスは、培地中の血清の段階的かつ制御された剥奪を受けます。9 Days In Vitro (DIV) 以降、スライスは HS なしで NBA で維持されます。

2. PI取り込みアッセイ

>注:細胞死は、蛍光色素ヨウ化プロピジウム(PI)の細胞内取り込みを監視することによって評価されました。PIは極性化合物であり、損傷した細胞膜を持つ細胞に侵入し、赤色蛍光を発するDNAと相互作用します(吸光度493nm、発光630nm)。PIは生細胞に透過しないため、集団内の死細胞を検出するために使用されます。

1. PIインキュベーション
   1. 培地で、PIストックを新たに1:10に希釈して調製します。
   2. PI取り込みアッセイの場合は、プレートをインキュベーターから取り外し、インサートを慎重に持ち上げます。P20ピペットで培地に13μLのPIを加え、最終濃度2μMを得る。スライスの下に気泡がないことを確認してください。
   3. スライスを37°Cのインキュベーターに2時間戻します。
   4. 次のセクションで説明するように、免疫組織化学プロトコールに進みます。PIは光に敏感であるため、プレートをアルミニウムで覆います。

3. 免疫組織化学

>注:免疫組織化学では、ニューロン特異的抗体、およびミクログリアとアストロサイトの安静時および反応性の表現型を識別できる抗体を使用して、鼻皮質-海馬てんかん様器官型スライスのニューロン死と神経膠症の程度を評価しました。

1. 組織固定
   1. インキュベーターからプレートを取り外し、培地を吸引します。P1000ピペットでスライスの下と上に1 mLのPFAを加えて、スライスを4%パラホルムアルデヒド(PFA)でRTで1時間固定します。
   2. PFAを取り出し、PBSを1mL加えます。また、スライスの下と上にPBSを追加します。
   3. スライスは、さらに使用するまでPBSで4°Cに保ちます。乾燥を避けるために、常にプレートの周りにパラフィルムを貼ってください。
2. 免疫染色ステップ
   1. PBS1mLで1回10分ずつ2回洗浄します。
   2. PBS中に1% Triton-X100、10% HS、および10% BSAを含有する透過処理/ブロッキング溶液を調製します。5%BSA溶液を調製します。
   3. 疎水性ペンで2つの長方形を描きます(図2A)。インサート(図2B)からスライスを非常に鋭利な刃で切り取ります。スライドごとに2つのスライス(図2C)を入れ、P200ピペットを使用して、各スライスの上に140μLの透過/ブロッキング溶液を追加します。RTで3時間インキュベートします。
   4. 一次抗体をPBS中の5% BSAで作業希釈液に希釈します。一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。
   5. 二次抗体と室温で4時間インキュベートします。このステップから、蛍光色素が使用されているため、プレートを光から保護します。
   6. 各スライスの上部に50 μLのHoechst溶液を滴下し、室温で20分間インキュベー
   トします。
   7. インキュベーションの合間に洗ってください。必ずPBS-Tで3回、毎回10分間洗ってください。
   8. Hoechstを取り外し、推奨どおりに洗います。
   9. 各スライスの上部に50μLの封入剤を加えます。ガラスのカバースリップで覆い、マニキュアで囲みます(図2D)。
   10. RTで24時間乾燥させます。
   11. 共焦点顕微鏡で免疫染色を視覚化します。染色したスライスを-20°Cに保ちます。

結果

図1:鼻皮質-海馬器官型スライスの調製に関する詳細な手順。(A)脳を頭から取り出し、背側を上にして氷のように冷たいGBSSに入れます。(B)鉗子を小脳に挿入します。正中線を通して脳を開き、海馬の上の余分な組織を取り除きます。(C)矢印で示されているように、海馬の下にヘラを切って。(D)両方の海馬を上向きにして平行に濾紙の上に置き、ティッシュチョッパーで350μmのスライスをカットします。(E)スライスした海馬を氷のように冷たいGBSSに入れます。(F)先端が丸いガラス電極を使用してスライスを分離します。(G)無傷の鼻皮質と海馬を描いたスライスのみを選択してください。(H、I)先端が丸いガラス電...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50 mL遠心チューブ、円錐形底部	コーニング	430829
70%エタノール	マヌエル・ヴィエイラ、LDA	UN1170
アンチNeuN(ウサギ)	ヴェルフェン	16712943S	1:500の比率で希釈します
B-27™サプリメント(50X)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504-044
メスのハンドル用ブレード	ファインサイエンスツール	10011-00
ウシ血清アルブミン(BSA)	NZYTech	MB04602	5% BSAは、一次抗体を希釈するために使用されます。10mLのPBSに0.5gのBSAを加えます。
ブレイン/ティッシュスライスチャンバーシステム	ワーナー・インストゥルメンツ
細胞培養インサート、30 mm、親水性PTFE	ミリポアSAS	PICM03050
冷光源	ショット	KL 300 LEDの
共焦点レーザー顕微鏡	ツァイス	LSMの710
従来のインキュベーター	サーモサイエンティフィックヘレウス	BB15、ファンクションライン	37°C、CO2を5%に設定
D(+)-グルコース一水和物	メルクミリポア	1.08342.1000
D-(+)-グルコース溶液、45%水溶液	シグマ	G8769
リン酸水素二水和物	メルクミリポア	1.06580.1000
解剖顕微鏡/拡大鏡	(株)明治テクノ	122285
ロバ抗ウサギIgG(H + L)とAlexa Fluor 488の組み合わせ	インビトゲン	A21206の	1:500の比率で希釈します
デュモン #5 ファイン フォーセプス バイオロジー イノックス	ファインサイエンスツール	11254から20
デュモン #5 鉗子スタンダード イノックス	ファインサイエンスツール	11251から20
デュモン #7 フォーセプス スタンダード デュモクセル	ファインサイエンスツール	11271-30
デュモンメディカル #7S 鉗子ショートカーブイノックス	ファインサイエンスツール	11273-22
ゲンタマイシン原液、50 mg/mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15750-037
ゲイの平衡塩溶液(GBSS)	バイオ産業	01-919-1A
ガラス電極	サイエンス製品	GB150F-10	ラウンドチップ自家製
ガラス製パスツールピペット、230 mm	VWRインターナショナル	〒612-1702
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	24020-091
ホースセラム、ヒート不活化(HS)
塩酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒26050-088
疎水性ペン	メルクミリポア	1.09057.1000
INCUラインIL10	ダコ	S200230-2
アイリススパチュラカーブ	ワーナー・インストゥルメンツ	BSC-HT Haasトップ
ラボカルチャークラスII生物学的安全キャビネット	ファインサイエンスツール	10092-12
レンズクリーニングペーパー	HERAサフェ	HSの12
L-グルタミン溶液 200 mM (Q)	ティフェン
マイクロチューブ 0.5 mL、PP	メルクミリポア	1.05886.0500
マイクロチューブ 1.5 mL、PP	ザルシュテット	72,699
マイクロチューブ 2.0 mL、PP	ザルシュテット	72.690.001
ミロスコープ カバー メガネ, 24 mm x 60 mm	サッターインストゥルメント	MP-285
ネールポリッシュ	マリエンフェルド	102242
ニューロバサル-Aミディアム(NBA)	決まり文句
Opti-MEM® I 低血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10888-022
パラホルムアルデヒド、粉末状	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31985-047
蠕動ポンプ	VWRケミカルズ	2,87,94,295
リン酸生理食塩水バッファー(PBS)	ギルソン	M312
リン酸標準液、PO43-水中			ホームメード。0.5% Tween-20 (PBS-T) を含む PBS は、免疫組織化学アッセイ中にスライスを洗浄するために使用されます。
ピペットセット	BDHアリスター	452232Cさん
プラチナ5ブレード	ギルソン	P2、P10、P20、P100、P200、P1000
ヨウ化プロピジウム(PI)	シグマ・アルドリッチ	P5405-250グラム
定性的濾紙、セルロース、グレード1、55 mm	シグマ・アルドリッチ	P4170-25MG	水溶液を1 mg / mLで保存します。
定性的濾紙、セルロース、グレード1、90 mm	ワットマン	1001-055	ミディアムリテンション 11μm
メスのハンドル	ワットマン	1001-090	ミディアムリテンション 11μm
スリップチップインスリンシリンジ(針なし) 1 mL	ファインサイエンスツール	91003から12
学生用ハサミ ストレートシャープシャープ 12cm	アストロメッド株式会社 GRASS製品グループ	S48刺激装置
SuperFrost Plus™ 接着スライド	ファインサイエンスツール	91402から12
TC処理滅菌60 x 15mm組織培養ディッシュ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	J1800AMNZ
TC処理滅菌6ウェルプレート	コーニング	CORN430166
ティッシュチョッパー	メディカルシステムズ(株)	TC-102
トリトンX-100	The Mickle Laboratory Engineering Co., LTD.(ミックル研究所エンジニアリング株式会社)	MTC/2	350 μmに設定
Tween-20 (トゥイーン 20	BDHの	14630
	シグマ	P2287

の ナトリウム 千株 の の )