線虫における化合物の神経保護効果を同定するためのPolyQアグリゲーションアッセイ

要約

出典:Wang, Q. et al.ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしての< href="https://app.jove.com/v/63081">Caenorhabditis elegans。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、線虫の体壁筋細胞におけるpolyQ凝集を減少させ、凝集に関連するタンパク質毒性を改善する神経保護試験化合物の保護電位をスクリーニングするin vivo法について説明しています。

プロトコル

1. PolyQアグリゲーションアッセイ

1. polyQ凝集アッセイのための線虫の調製
   1. OP50(OD₅₇₀ 0.7-0.8)と5 mg/mLのアストラガランを含む500 μLのS培地(通常は1回の治療につき1ウェル、1つの時点で1ウェル)を入れた48ウェルプレートの各ウェルに、AM141の300-500同期L1幼虫を移します。
   2. プレートをパラフィルムで密封し、20°Cおよび120rpmで24時間、48時間、72時間、96時間インキュベー
   トします。
   3. 滅菌済みの1.5mL微量遠心チューブで線虫を採取し、遠心分離によりM9バッファーで>3回(1000 × gで1分間)洗浄し、残りのOP50を除去します。AM141線虫をM9バッファーに再懸濁し、画像取得の準備をしておく。
2. 蛍光画像の取得とデータ解析
   注:データは、このハイコンテントイメージングシステムで自動的に分析されます。自動イメージングデバイスが利用できない場合は、画像取得用のアガロースパッドを調製する従来の方法を使用して、一般的な蛍光顕微鏡を使用することで同様の性能を得ることができます。
   1. 10〜15個の線虫を384ウェルプレート内の各ウェルに移します(最終容量はウェルあたり80μL)。各処理に10個の複製ウェルを設定します。
   2. 各ウェルに200 mMアジ化ナトリウム10 μLを加えて、線虫を麻痺させ、底まで落ち着かせます(5〜10分)。
   3. プレートをハイコンテントイメージングシステムに置いて、蛍光画像を取得します(デバイスおよびソフトウェア情報については、材料の表を参照してください)。
   4. 画像取得ソフトウェアを開き、次のパラメータを設定します。
      1. Plate Acquisition Setupウィンドウを開き、新しい実験セットと名前を作成します。
      2. [倍率] を 2x、[カメラビニング] を 1、[プレートタイプ] を [384 ウェルプレート] として選択します。
      3. 訪問する井戸とサイト (単一サイト) を設定します。
      4. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルターを選択し、画像ベースのフォーカスオプションを有効にします。
      5. 露出を300 ms.
         に設定します。 手記：上記の設定をテストおよび調整して、イメージングパラメータを最適化できます。
      6. 画像取得設定を保存し、[Acquire Plate]ボタンをクリックして実行します。
   5. 画像解析ソフトウェアを使用して画像データを解析します。
      1. 「Review Plate Data」ウィンドウを開き、画像解析用のテストプレートを選択します。
      2. テストウェルをダブルクリックすると、その画像が表示されます。
      3. 解析方法としてCount Nucleiを選択し、Configure Settingsボタンをクリックすると、以下の設定のウィンドウが表示されます。
      4. FITC チャネルからソース イメージを定義し、標準アルゴリズムを選択します。
      5. 画像解析パラメータを次のように設定します。おおよその最小幅 = 10 μm (= 2 ピクセル)、おおよその最大幅 = 50 μm (= 12 ピクセル)、ローカル背景より上の強度 = 1,000-2,000 グレーレベル。
      6. 現在の設定をテストして、分析方法を最適化します。
      7. 設定を保存し、すべてのウェルで解析を実行します.
         手記：1 枚の 384 ウェルプレートの解析が終了するまでに ~20 分かかります。
      8. Total Nucleiを各ウェルのQ40::YFP凝集体の総数としてエクスポートします。
   6. 各ウェル内の線虫の数を数えます。
   7. 各グループの線虫あたりのQ40::YFP凝集体の平均数を計算し、各時点からのデータに非線形曲線近似を適用します。
   8. 阻害指数を計算します:
      阻害指数 = (N_{コントロール} - N_サンプル) / Ncontrol
      ここで、N_{コントロール}と N_サンプルは、それぞれコントロール群と治療グループにおける Q40::YFP 凝集体の平均数です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C.エレガンス株
AM141 rmIs133 [UNC-54P::Q40::YFP]	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
大腸菌株
OP50	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
試薬
アジ化ナトリウム	シノファーム化学試薬株式会社	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
備品
384ウェル細胞培養プレート	ネストバイオテクノロジー(株)	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=ja&product_id=85
48ウェル細胞培養プレート	ネストバイオテクノロジー(株)	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=ja&product_id=85
蛍光顕微鏡	広州マイクロショット光学技術有限公司 (Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.)	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
ハイコンテントイメージングシステム	分子デバイス	ImageXpressの	https://www.moleculardevices.com/ 製品/細胞イメージングシステム#High-Content-Imaging
マイクロ遠心分離機	ジーンカンパニー	ジェネスピードX1	https://www.genecompany.com/ index.php/ホーム/商品/goodsdetails/gid/189.html
パラフィルムM	シグマ・アルドリッチ	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
顕微鏡デジタルカメラ	広州マイクロショット光学技術有限公司 (Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.)	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
ソフトウェア
画像取得および解析ソフトウェア	分子デバイス	メタエクスプレス	https://www.moleculardevices.com/ 製品/細胞イメージングシステム/取得・解析ソフトウェア/Metaxpress