方法論記事

線虫のPolyQ媒介性神経毒性に対する試験化合物の効果を研究するためのアッセイ

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、ポリQを介した神経毒性から線虫Caenorhabditis elegansの神経生存に対する試験化合物、アストラガランの神経保護効果を評価する方法について説明します。このアッセイでは、ASHニューロンでGFPに融合した異常に拡大したpolyQリピートを発現する線虫Caenorhabditis elegansを使用して、試験化合物処理後のニューロンの生存率を測定します。

プロトコル

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1. PolyQを介した神経毒性アッセイ

  1. C.エレガンス(C.elegans)の試験サンプルによる治療
    1. polyQ 神経毒性アッセイ用の線虫を調製するには、HA759 の 300-500 同期 L1 幼虫を OP50 を含む 500 μL の S 培地 (OD570 0.7-0.8) と 5 mg/mL のアストラガランを含む 48 ウェルプレートの各ウェルに移します。
    2. プレートをパラフィルムで密封し、15°C、120rpmで3日間インキュベー
      3. トします。
    3. 線虫を遠心分離により回収し、M9緩衝液で3〜5回洗浄する。線虫をM9バッファーに再懸濁して、ニューロンの生存および回避アッセイに使用します。
  2. アガロースパッドの調製
    1. 2 gのアガロースを100 mLのM9バッファー(2%、w / v)に加え、アガロース溶液を電子レンジで沸騰近くまで加熱します。
    2. 0.5 mLの溶融アガロースを、厚さ2 mmのガラスプレート2枚の間に挟んだ厚さ1 mmの顕微鏡スライドガラスの中央に分注します。別のスライドで垂直に覆います。アガロースが冷えて固まったら、トップスライドをそっと取り外します。
  3. ASHニューロンサバイバルアッセイ
    1. 20 mMのアジ化ナトリウムをアガロースパッドに一滴加えます。15-20 HA759センチュウをドロップに移して固定します。
    2. カバースリップを線虫の上にそっと置きます。スライドは、デジタルカメラを取り付けた蛍光顕微鏡の下に置いてください。40倍対物レンズとFITCフィルターを選択して、線虫の頭部領域のGFP陽性ASHニューロンを検出します。
    3. 各グループで50個以上の線虫をランダムに選択し、頭部領域にGFP標識両側ASHニューロンを有する線虫の数を数えます。ASHニューロンの生存率を計算する:
      神経細胞の生存率 (%) = figure-protocol-1
      ここで、N生存率およびN合計は、GFP陽性ASHニューロンを有する線虫の数および各グループにおける試験された線虫の総数である。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C.エレガンス株
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)https://cgc.umn.edu/strain/HA759
大腸菌株
OP50カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)https://cgc.umn.edu/strain/OP50
試薬
アガロースバイオウエスト111860
アジ化ナトリウムシノファーム化学試薬株式会社80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551E96FF5F07CD
備品
48ウェル細胞培養プレートネストバイオテクノロジー(株)748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
蛍光顕微鏡広州マイクロショット光学技術有限公司 (Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.)Mshot MF31-LEDhttps://www.mshot.com/article/442.html
ハイコンテントイメージングシステム分子デバイスImageXpress Pico (イメージプレス ピコ)https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
マイクロ遠心分離機ジーンカンパニージェネスピードX1https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
顕微鏡デジタルカメラ広州マイクロショット光学技術有限公司 (Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.)MS60https://www.mshot.com/article/677.html
マイクロ波美的 M1-211A型https://www.midea.cn/10000/10000000001
パラフィルムMシグマ・アルドリッチP7793-1EAhttps://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
ソフトウェア
画像取得および解析ソフトウェア分子デバイスメタエクスプレスhttps://www.moleculardevices.com/ 製品/細胞イメージングシステム/取得・解析ソフトウェア/Metaxpress
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タグ

Caenorhabditis elegansASHGFP

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