浸透圧回避アッセイを用いたトランスジェニック線虫の化学回避挙動の検討

Abstract

出典:Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、トランスジェニック線虫モデルにおける化学回避行動を調べるための浸透圧回避アッセイについて説明しています。回避行動は、高浸透圧バリアと化学誘引剤の存在下でプレートでテストされます。ニューロンの機能的喪失を患った線虫は、走化性物質に引きつけられ、高浸透圧障壁を通過し、麻酔薬の溶液のためにトラップゾーンで麻痺します。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>注:このプロトコルで使用される溶液のレシピについては、表1を参照してください。

>1. 線虫アッセイのための材料の準備

1. C.エレガンス株の維持
   1. 線虫(AM141およびHA759)および大腸菌(OP50およびNA22)株を入手します(材料表を参照)。
   2. 大腸菌OP50を播種した線虫増殖培地(NGM)プレート上で、AM141の場合は20°C、HA759の場合は15°Cで線虫を維持します。
2. 大腸菌OP50細菌培養物の調製
   1. Luria-Bertani(LB)ストリークプレートから大腸菌OP50のコロニーを1つ選択し、50 mLの液体LB培養物に接種します。
   2. OP50 バクテリアをシェーカーで 37 °C、200 rpm でインキュベートし、光学密度が 570 nm で ~0.5 になるまでインキュベートします (OD₅₇₀)。
   3. OP50細菌培養液は4°Cで保存し、2週間以内にご使用ください。
3. OP50細菌を用いたNGMプレートの調製
   1. 20 gの寒天、2.5 gのペプトン、3.0 gのNaCl、および975 mLの脱イオン水を1 Lのオートクレーブ可能なボトルに加えます。オートクレーブを121°Cで30分間保存します。
   2. 液体NGM寒天瓶をベンチに置いて~60°Cに冷却した後、1 mLの1 M CaCl₂、1 mLの1 M MgSO₄、1 mLの5 mg/mLコレステロール1 mL、および25 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)の滅菌ストック溶液を加えます。
   3. 滅菌済みの90 mmシャーレに20 mLのNGMを注ぎ、プレートをベンチに置いて冷まして固めます。プレートを逆さまにして、室温のベンチで2日間乾燥させます。
   4. OP50細菌培養物200 μLを各NGMプレートに分注し、滅菌ガラスコーティングロッドで均一に広げます。蓋を閉め、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
   5. OP50を播種したNGMプレートは、カバー付きのプラスチック箱に室温で保存し、2週間以内に使用してください。
4. 年齢同期したC.エレガンス集団の調製
   1. 妊娠した成虫の線虫を滅菌済みの1.5mL微量遠心チューブに集め、1000×gで1分間遠心分離する。3回洗浄し、線虫をM9緩衝液に再懸濁する。
   2. 等量の漂白剤溶液を加え、3〜5分間穏やかに攪拌し、解剖顕微鏡で15秒ごとに漂白を監視します
      手記：漂白剤溶液は、使用前に10%NaOClと1MのNaOHを等量混合して新たに調製する必要があります(表1)。
   3. ほとんどの線虫が壊れたら、M9バッファーで希釈して消化を停止します。迅速に遠心分離して上清を取り除き、ペレットをM9バッファーに再懸濁して、洗浄を3回繰り返します。
   4. ペレットをS媒体に再懸濁します。卵が上清に残っている間、線虫の残留物を重力によって2〜3分間落ち着かせます。
   5. 上清を新しい滅菌マイクロ遠心チューブに吸引します。卵を1000 × gで1分間遠心分離して収集します。
   6. 上清を~80%廃棄し、卵を20mLのS培地が入った滅菌フラスコに移します。フラスコをシェーカーに入れ、卵を餌なしで120rpmで一晩インキュベートして、同期したL1線虫を得る。

2. PolyQを介した神経毒性アッセイ

1. C.エレガンス(C.elegans)の試験サンプルによる治療
   1. polyQ 神経毒性アッセイ用の線虫を調製するには、HA759 の 300-500 同期 L1 幼虫を OP50 を含む 500 μL の S 培地 (OD570 は 0.7-0.8) と 5 mg/mL のアストラガラン (通常は各処理に 3 つのレプリケートウェル) を入れた 48 ウェルプレートの各ウェルに移します。
   2. プレートをパラフィルムで密封し、15°C、120rpmで3日間インキュベー
   トします。
   3. 線虫を遠心分離により回収し、M9緩衝液で3〜5回洗浄する。線虫をM9バッファーに再懸濁して、ニューロンの生存および回避アッセイに使用します。
2. 浸透圧回避アッセイ
   1. 食品不使用のNGMプレート(9 cm)を、中央の8 Mグリセロール(~30 μL)ラインでノーマル(N)ゾーンとトラップゾーン(T)に分けます。200 mMのアジ化ナトリウム(~20 μL)ラインをグリセロールラインから~1 cm離れた場所に広げて、グリセロールバリアを通過する線虫をゾーンTに麻痺させます。
   2. ~200個の線虫を、各グループごとに3つの複製プレートのゾーンNに移します。1%ブタンジオン(~2μL)をゾーンT(プレートの端から1cm)に滴下して、線虫を引き付けます。すぐにペトリ皿の蓋をして、23°Cで90分間インキュベートします。
   3. 顕微鏡下でNゾーンとTゾーンの線虫の数をスコアリングします。eq.
      を使用して回避指数を計算します 回避指数 = N /(T + N)
      ここで、NとTはそれぞれNゾーンとTゾーンの線虫の数です。データは、>3 回の独立した実験を代表する 3 回の反復の平均±標準偏差 (SD) として表されます。
   4. 対応のない両側 t 検定を実行して、アストラガラン群と対照群のデータを比較します。

表 1:

る る る ます る してください ます ます る します。 ます します。 します。 します。 ます します 。 ます します。 に加えます。 る

解決	準備手順	貯蔵
1 M CaCl2	111 g CaCl2	室温で保存(RT)
	dH2Oを1 Lに加え
	オートクレーブ
1 M リン酸カリウム (pH 6.0)	108.3 g KH2PO4	RTでストア
	35.6 K2HPO4
	dH2Oを1 Lに加え
	オートクレーブ
1 M MgSO4	246 g MgSO4・7H2O	RTに保管
	dH2Oを1 Lに加え
	オートクレーブ
エタノール中のコレステロール(5 mg / mL)	コレステロール0.5g	-20°Cで保存
	エタノールを100mLに加え
	オートクレーブしないでください!
1 M クエン酸カリウム (pH 6.0)	10.0gのクエン酸一水和物を加えます	RTでストア
	146.75 gの三カリウムクエン酸一水和物を加えます
	dH2Oを1 Lに加え
	オートクレーブ
微量金属溶液	0.93 g EDTA二ナトリウム	RTで暗闇に保管
	0.345 g FeSO4・7H2O
	0.1 g MnCl2・4H2O
	0.145 g ZnSO4・7H2O
	0.0125 gのCuSO4・5H2Oを加えます
	dH2Oを500 mLに加え
	オートクレーブ
1 M NaOH	4 g NaOH	RTに保管
	dH2Oを100 mLに加え
漂白剤溶液	1 M NaOH 0.5 mL	使用前に新たに準備してください
	10% NaOCl 0.5 mL
M9バッファ	5 g NaCl	RTで保存
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	dH2Oを1 Lに加え
	オートクレーブ
	1 mL の 1 M MgSO4 を添加
>S 基礎	5.85 g NaCl	RTで保存
	6.0 g KH2PO4
	1.0 g K2HPO4
	dH2Oを973 mLに加え
	オートクレーブ処理を行い、~60°Cまで冷却
	エタノールに5 mg / mLコレステロール1 mLを追加します
S 中	S基礎	RTで保存
	1 M CaCl2 3 mL を添加
	1 M MgSO4 3 mL を添加
	10 mLの1 Mクエン酸カリウムを加え
	微量金属溶液10mLを加えます
	すべてのコンポーネントはオートクレーブ処理されており、オートクレーブ処理は行っていません
5 mg/mL アストラガラン	アストラガラン 0.1g	-80°Cでアリコートに格納
	S培地20mLを加えます
	0.22 μmシリンジフィルターによるフィルター
>200 mM アジ化ナトリウム	1.3 g NaN3	4°Cで保存
	S培地100mLを加えます
8 M グリセロール	73.67 gグリセロール	RTに保管
	dH2Oを100 mLに加え
10%ブタンジオンストック	10 μL のブタンジオンと 90 μL の dH2O を混合	RTでストア
1%ブタンジオン	10 μL のブタンジオンストックを 90 μL の dH2O	RTでストア
1 L の Luria-Bertani (LB) 文化	NaCl 10 g	RTで保存
	トリプトン 10 g
	酵母エキス5g
	dH2Oを1 Lに加え
	オートクレーブ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C.エレガンス株
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
大腸菌株
NA22	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
試薬
寒天	上海EKEARバイオテクノロジー株式会社	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
ブタンジオン	シノファーム化学試薬株式会社	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0
コレステロール	シグマ・アルドリッチ	C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
グリセロール	アラジン株式会社	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
ペプトン	広東HuanKai微生物科学技術有限公司	050170Bの	https://www.huankai.com/show/21074.html
アジ化ナトリウム	シノファーム化学試薬株式会社	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
水酸化ナトリウム	シノファーム化学試薬株式会社	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6
次亜塩素酸ナトリウム溶液	広州化学試薬工場	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
トリプトン	オクソイド株式会社	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
酵母エキス	オクソイド株式会社	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
備品
48ウェル細胞培養プレート	ネストバイオテクノロジー(株)	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
90mmシャーレ	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (三言生物科技(上海)有限公司)	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
オートクレーブ	パナソニック	MLS-3781L-パソコン
解剖顕微鏡	重慶光学有限公司 ChongQing Optical Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
マイクロ遠心分離機	ジーンカンパニー	ジェネスピードX1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
パラフィルムM	シグマ・アルドリッチ	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
シェーカー	Zhicheng株式会社	ZWY-2102Cの	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html