共培養におけるマウス筋芽細胞の移動能力を評価するための創傷アッセイ

要約

出典:Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、マウスの筋芽細胞の遊走能力を評価するための非接触共培養創傷治癒アッセイについて説明しています。これは、パラクリンの非標準的なWntシグナル伝達相互作用のシグナル送信およびシグナル受信コンポーネントをin vitroで理解するのに役立ちます。

プロトコル

1. 創傷アッセイ:

(図1はアッセイの概略モデルの概要を示しています)

1. O9-1細胞インサートとC2C12細胞チャンバーウェルをインキュベーター内で接着し、増殖させてから、両方の細胞が~70-80%のコンフルエントになるまでしてから、プロトコルのこの部分を進めてください。細胞が>90%コンフルエントに増殖する場合は、細胞がウェルから分離するだけなので、スクラッチアッセイを続行しないでください。
2. 1x PBSとC2C12培地を37°Cのウォーターバスに入れて温めます。
3. C2C12チャンバーウェルから上清培地を取り除き、1x PBSで細胞を一度洗浄します。1x PBSを取り外し、すぐに滅菌済みのP10ピペットチップで細胞を引っ掻きます。
   1. 滅菌済みP10ピペットの先端を、細胞単分子膜の全長または幅(右から左、上から下など)に一方向にしっかりと通します。細胞を含む各ウェルを引っ掻くのは必ず一度だけしてください.
      手記：スクラッチ結果を最適化するには、異なる実験条件のウェルを同程度のコンフルエンシーレベルでスクラッチします。これを行うには、各4チャンバーウェルに、必要な実験条件(例:ウェル#1ネガティブコントロール、ウェル#2ポジティブコントロール)の細胞があることを確認します。さらに、引っかき傷ごとに新しい滅菌P10ピペットを使用し、毎回ピペットに同量の力を加えます。各ウェルに複数のスクラッチを作成しようとしないでください。
   2. 引っ掻いた後、P1000ピペットチップを使用して1 mLの1x PBSをウェルに戻します。傷がつくウェルごとにこのプロセスを繰り返します。
      手記：各スクラッチに関連する変動性を考慮すると、各実験条件での創傷作成には複数のウェル(n = 3)を使用することが推奨される。これらのステップで細胞が1x PBSがない期間を最小限に抑えることが重要であるため、迅速に作業してください。各ウェルから1x PBSを除去した後、各ウェルに傷を生じさせるのに5秒以上かからないようにする必要があります。
4. 創傷を作製し、各ウェルに1x PBSを戻した後、明視野倒立顕微鏡を使用して傷を画像化し、この画像をベースライン創傷サイズ(時間0)として使用します。画像を撮影するには、次の手順を実行します。
   1. 電源ボタンを押して、コンピューターと顕微鏡の電源を入れます(資料の表を参照)。チャンバースライドをステージに置き、対物レンズダイヤルを5倍に回転させます。
   2. コンピュータのデスクトップ上のソフトウェアアイコンをダブルクリックして、イメージングソフトウェア(資料の表を参照)を開きます。ソフトウェアのホーム画面の[カメラ]タブをクリックします。「Live」ボタンをクリックして、「AxioCam IC」タブでセルを視覚化します。
   3. ライトフィルターが完全に引き出され、カメラとコンピューターの画面に光が通るようにします。チャンバースライドを手動で移動および/または回転させて、AxioCam ICタブのライブ画像の中央に創傷領域を配置します。
   4. 画像を撮影するには、スナップをクリックして、画像を含む AxioCam IC タブの隣に新しいタブを開きます。
   5. この静止画像を保存するには、ソフトウェアのホームページの左上にある[ファイル]|[名前を付けて保存]をクリックし、[ファイル名]ボックスにファイル名を入力します。図をCarl Zeiss画像(* .czi)形式(デフォルト設定)で保存し、左側のバーでデスクトップを選択して、ファイルをZen lite 2012ソフトウェアプログラムでのみ開くことができる.cziファイルとしてデスクトップに保存します。
   6. 画像を.tiffとして保存するには、[ファイル]、[名前を付けて保存]、[ファイル名を入力] の順にクリックします。「ファイルの種類」ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから「*.tiff」を選択して、図をタグ付き画像ファイル(*.tiffとして保存します。
      手記：.tiff形式は、どの画像処理ソフトウェアでも開くことができます。
   7. チャンバースライドを手動で再配置して、同じウェル内の傷の他のポイントでさらに2〜3枚の画像を撮影します.
      手記：合計すると、各ウェルの傷の3〜4枚の重ならない高倍率画像が得られます。
5. 各ウェルから1x PBSを取り出し、1 mLのC2C12培地を加えます><。 手記：創傷発生後にチャンバーウェルに溶液を取り出したり追加したりする際には、細胞がチャンバーウェルから剥離する可能性があるため、ピペットを過度に動かさないように注意してください。さらに、チャンバーをウェルチルトして、各ウェルの角で溶液の吸引と再導入を行い、細胞の単層破壊を最小限に抑えることができるようにします。
6. O9-1細胞を含むインサートをチャンバーウェルの各ウェルに手動で配置することにより、ウェルインサート共培養システムを組み立てます。インサートの底が下にあるC2C12細胞のすぐ上にくるように、インサートをウェルにゆっくりと押し込みます。ウェルインサートコンストラクトをインキュベーターに戻します.
   手記：インサートの底部が物理的に接触し、下にあるC2C12細胞を機械的に破壊しないようにしてください。
7. セルを合計9〜12時間移動させます。最適な移動時間を決定するには、創傷形成後6時間で細胞をチェックし、その後は2〜3時間ごとに細胞を確認します。コントロールまたはポジティブコントロール条件の細胞が創傷を完全に覆い始めたら、実験を終了します。
   手記：コンストラクトの非接触性を考えると、インターバルマイグレーションの進行を確認する際に、上にあるインサートをウェルから取り外す必要はありません。遊走性の変動性は、このアッセイで使用される細胞の種類、創傷発生時の細胞密度、作成された創傷の幅、および操作された細胞の実験条件(遺伝子ノックダウン、組換えタンパク質の追加など)などの要因に応じて観察されます。これらの試薬の濃度は、メーカーの推奨によるガイダンスに従って実験的に決定する必要があります。

結果

図1:アッセイの概略モデル。ステップ1には、STOフィーダー細胞を使用したC2C12筋芽細胞およびNCCのin vitro増殖が含まれます。ステップ2では、共培養システムにおけるNCCおよびC2C12細胞のプレーティングを行います。ステップ3には、細胞移動能力を評価するために、基礎となるC2C12細胞で実施される創傷アッセイが含まれます。ステップ4では、ファロイジンの免疫染色を行い、遊走した細胞の細胞学的構造と形態を評価します。略語:NCCs =神経堤細胞;Ab =抗体。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C2C12マウス筋芽細胞株	ATCCの	CRL-1772
チャンバースライドシステム、4ウェル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	154526
ダルベッコ修正イーグルスミディアム(DMEM)、高グルコース(4.5 g / L)、グルタミン(2 mM)	コーニング	10-017-CV	4°Cで保存
目盛り付き滅菌ピペットチップ、10 μL	USAサイエンティフィック	〒1111-3810
O9-1神経堤細胞株	ミリポアシグマ	SCC049
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1x、カルシウムおよびマグネシウムなし、pH 7.4	コーニング	21-040-履歴書	4°Cで保存
0.4 μM 透明 PET メンブレンを備えた 24 ウェルプレート用の Falcon 透過性サポート	コーニング	353095
ウシ胎児血清	フィッシャーサイエンティフィック	W3381Eの	50 mL アリコートに -20 °C で保存
ツァイス倒立型Axio Vert.A1光学顕微鏡	カールツァイスAG
Zen lite 2012顕微鏡ソフトウェア	カールツァイスAG		イメージングソフトウェア

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