方法論記事

化学共役抗体-抗原コンジュゲートを検証するための酵素結合免疫吸着アッセイ

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2025年7月8日

この記事について

要約

出典:Volckmar, J. et al., Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)技術による化学的に結合した抗体-抗原複合体の検出を示しています。捕捉された抗体は、抗体-抗原複合体の抗原の特異的エピトープに結合し、後で酵素結合二次抗体を用いて可視化することができます。

プロトコル

1. ハイブリドーマ細胞株NLDC-145からのαDEC-205の作製

  1. 抗体産生のためには、凍結保存したNLDC-145細胞をαDEC-205を産生する細胞を水浴中で37°Cで解凍します。セルを37°Cおよび5%CO2で増殖させます。抗体産生に進むには、75 cm2 ボトルが 2 本必要になります。細胞培養手順は、安全な作業条件を確保し、培養物の汚染を防ぐために、安全キャビネット内で実行する必要があります。
    1. 解凍した細胞1 mL(1 x 106 - 5 x 106細胞/mL)を、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに予熱)を添加したISF-1培地9 mLに1 mLを細胞培養フラスコ(25 cm2)に再懸濁します。フラスコを37°C、5%CO2の細胞培養インキュベーターに水平に置きます。
    2. 細胞を37°Cおよび5%CO2で、70%コンフルエントになるまで培養します。これは通常、24〜48時間後に達成する必要があります。
    3. 細胞が70%コンフルエントになったら、1〜10 mLの容量範囲のピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、完全なNLDC-145細胞懸濁液(10 mL)を15 mLの円錐形遠心チューブに移します。細胞を250 x gで遠心分離し、室温で10分間ペレット
      4. 化します。
    4. ISF-1培地を水浴中で37°Cに予温し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した12 mLのISF-1培地にペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞懸濁液を新鮮な細胞培養フラスコ(75 cm2)に移します。
    5. 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したISF-1培地で、37°Cおよび5%CO2で細胞を培養および増殖し、70%がコンフルエントで99%が生存可能になるまで増殖します。これは通常、48〜72時間後に達成する必要があります。
    6. セルを2つの75 cm2フラスコに分割します。これを行うには、まず細胞培養フラスコの底部/培養表面を細胞懸濁液で洗い流し、表面からすべてのNLDC-145細胞を除去します。NLDC-145細胞懸濁液6 mLをそれぞれ2本の新鮮な75 cm2ボトルのいずれかに移し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した予熱済みのISF-1培地を最大12 mL
      手記：NLDC-145細胞が培地をコンディショニングするため、細胞培養培地を更新しないでください。細胞を培地と一緒に移し、新鮮な培地で所望の量まで培養物を満たします。これは、NLDC-145細胞による生存率と抗体産生の最大化に不可欠です。
    7. 細胞培養物を37°Cおよび5%CO2で、一般に48〜72時間後に達成される約70%のコンフルエントになるまで拡大します。
    8. 細胞が70%コンフルエントになったら、75 cm2ボトルのそれぞれから10 mLの増殖NLDC-145細胞懸濁液を1つのPETG(ポリエチレンテレフタレートグリコール)ローラーボトル(1,050 cm2)に移します。このためには、細胞培養フラスコの底部/培養表面を細胞懸濁液で洗い流し、ピペットコントローラーと10mLピペットを使用して表面からすべての細胞を除去します。
    9. 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (37 °C に予熱) を添加した 140 mL の ISF-1 培地を培地ボトルから直接取り出して、ローラーボトルを含む NLDC-145 のそれぞれに 150 mL マークまで充填します。
      手記：ステップ 1.1.6 の注を参照してください。
    10. ローラーボトルを37°C、5%CO2、25ラウンド/分で3日間培養します。
    11. 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに予熱)を添加したISF-1培地150 mLを、ローラーボトルを含むNLDC-145のそれぞれに追加し、300 mLのマークまで充填します。
    12. 300 mLを入れたローラーボトルを、それぞれ37°C、5%CO2、25ラウンド/分でさらに3日間培養します。
    13. 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに予熱)を添加したISF-1培地をさらに100 mL追加し、ローラーボトルを含むNLDC-145のそれぞれに400 mLのマークまで充填します。
    14. 400 mLのローラボトルをそれぞれ37°C、5%CO2、および25ラウンド/分でさらに7日間培養します
      手記：この週には、培養物が非常に密集し(最大95%の密度)、生存率が低下し(最大50%)、抗体の放出が最大限に増加します。
  2. 培養上清からαDEC-205を精製するには、NLDC-145細胞懸濁液(両方のローラーボトルから)を直接500 mLのオートクレーブ遠心分離ボトルに注ぎます
    手記：総量800mLの培養物を収集する必要があります。
    1. 培養物を8,600 x g、4°Cで30分間遠心分離し、細胞と破片を除去します。
    2. 上清を収集し、ペレットを廃棄し、上清を滅菌試薬ボトルにプールします。
      手記：αDEC-205の精製は、直ちに開始することも(ステップ2)、上清を4°Cで短期間保存することもできます。

2. NLDC-145細胞上清からのαDEC-205抗体の精製

>注:NLDC-145細胞上清から、αDEC-205はプロテインGセファロースカラム(再利用可能)を使用して精製されます。カラムの寸法は 15 mm x 74 mm で、1 カラムあたり 5 mL の Protein G セファロースが充塡されています。

  1. プロテインGセファロースカラムの調製と洗浄のために、プロテインGセファロースカラムの上部開口部に気密ゴム栓を取り付けます。2つの滅菌カニューレ(20 G x 1 1/2 "、0.90 x 40 mm)でゴムプラグに穴を開けます。
    1. 10mLシリンジを2つのカニューレのいずれかに接続し、フレキシブルシリコンチューブ(長さ約100cm、直径2.5〜3mm)をチューブコネクタ付きで2番目のカニューレに接続します><。 手記：シリンジ/ゴム栓構造は再利用可能で、真空を提供し、大量の培養上清をタンパク質Gセファロースカラムに連続的に流します。このためには、シリンジのプランジャーをわずかに引き戻して、次のステップで連続的な流体の流れを確保します。
    2. カラムを 50 mL の 0.1 M 氷酢酸(pH 2)で洗浄し、以前の抗体精製から残留する可能性のある抗体を除去します。シリコンチューブの端を0.1 M氷酢酸(pH 2)充填試薬ボトルに入れます。誘導された真空の結果として、50 mLの0.1 M氷酢酸(pH 2)がタンパク質Gセファロースカラムを滴下します
      注:0.1 M氷酢酸(pH 2)は、試薬ボトルに保存するか、ビーカーに新たに充填する必要があります。
    3. 100-200 mL リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でカラムを洗浄します。シリコンチューブの端をPBS充填試薬ボトルまたはビーカーに入れます。100〜200mLのPBSをプロテインGセファロースカラムに滴下します。
  2. NLDC-145上清から抗体を精製するには、NLDC-145上清(ステップ1.2.2.で得られたもの)800 mLをカラムにロードします。シリコンチューブの端をNLDC-145上清充填試薬ボトルに入れます。800 mLのNLDC-145上清をカラムに滴下します。
    1. カラムを 500 mL の PBS で洗浄します。シリコンチューブの端をPBS充填試薬ボトルまたはビーカーに入れます。500 mL PBSをカラムに滴下します。
    2. 溶出には、1.5 mLチューブ20本を使用し、1.5 mLチューブごとに1.5 mLチューブに100 μLの1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)をピペットで入れます。ゴム栓をカラムから取り外し、0.1 Mグリシン(pH 3)1 mLをプロテインGセファロースカラムの上部チャンバーにピペットで移し、カラムから抗体を溶出します。フロースルーを溶出液として、調製した 1.5 mL チューブの 1 つに直接回収します。
    3. 溶出ステップ(2.2.2.)を20本(1.5 mL)すべてについて繰り返します。
    4. 分光光度計を使用して、280 nm(OD280)でのすべての溶出画分の光学密度を決定し、抗体含有画分を同定します。
      手記：最初の溶出画分をブランクとして使用します。
    5. OD280が0.5より大きいすべての分数(約10分数)をプールします。
    6. 20%エタノールを充填したプロテインGセファロースカラムを4°Cで保存します。
  3. 1000 mL PBS(2000 mLビーカー内)に対して、分子量カットオフ(MWCO)が12〜14 kDaの透析チューブを使用して、4°Cで一晩、プールした溶出液を透析します。
    1. 透析チューブを20cmに切断し、透析チューブを10 mM EDTA(pH 7.5)の500-800 mLでビーカー内でホットプレートを使用して30分間煮沸し、汚染を除去します。10 mM EDTA(pH 7.5)溶液を廃棄し、透析チューブを脱イオン水で10分間煮沸します
      手記：透析チューブは、直接使用することも、次の使用まで0.01%アジ化ナトリウム(NaN3)/H2O溶液で4°Cで保存することもできます。
    2. 適切な透析チューブクロージャー/シングルピースのヒンジ付きクランプで透析チューブの底を閉じ、抗体溶出液を透析チューブに慎重にピペットで移します。透析チューブの上部を2つ目のクランプで閉じます。
    3. 透析チューブの上部クランプをフローティングスタンドに固定し、PBS充填ビーカーにマグネティックスターバーで組み付け、マグネチックスターラーにビーカーを載せます。
    4. 4°Cで攪拌しながら一晩透析します。
  4. αDEC-205の濃度を上げるには、全透析液を10 kDa MWCOの遠心濃縮器にロードします。チューブの1つのクランプを開き、透析チューブから完全な透析液を遠心濃縮器(10 kDa MWCO)に慎重にピペットで移します。
    手記：ピペットの先端で濃縮器の底部に触れないでください。
    1. 693 x g(2,000 rpm)および4°Cで30分間遠心分離します。
    2. 遠心濃縮器に10 mLのPBSをロードし、抗体溶液の最終残量が1〜1.5 mLになるまで、693 x g(2,000 rpm)および4°Cで遠心分離します><。 手記：必要に応じて、2.4.1の遠心分離ステップを繰り返します。希望の量に調整します。
    3. 分光光度計を使用して、280 nm(OD280)で濃縮されたαDEC-205溶液の光学密度を決定します。PBS をブランクとして使用します。
    4. 次の式を使用してαDEC-205の濃度を計算します:
      濃度 [mg/mL] = OD280/1.4。
    5. αDEC-205溶液を0.22μmシリンジフィルターユニットでろ過します.
      手記：NLDC-145ハイブリドーマ細胞上清からのαDEC-205の精製は、FPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィー)によっても達成できます。精製されたαDEC-205は、4°Cまたは-18°Cで長期保存することができます。

3. OVAとαDEC-205の化学結合

>注:最適な化学結合には、0.5 mgのOVAタンパク質と2.5 mgのαDEC-205(1:5)の比率が必要です。ただし、この比率は他のタンパク質や抗体では異なる場合があるため、代替コンジュゲート用に最適化する必要があります。OVAタンパク質のジスルフィド結合の還元は、αDEC-205への化学結合のためにスルフヒドリル基を露出させる30 mM TCEP-HClとのインキュベーションによって行われ、ステップ3.2では240 μlのTCEP-HClが必要です。TCEPによるOVAの還元(ステップ3.1.)とαDEC-205のスルホ-SMCC活性化(ステップ3.2.)の両方のステップは、できれば並行して実行する必要があります。

  1. 125 mM TCEP-HCl溶液(pH 7.0)を新たに調製します。必要な量のTCEP-HClを秤量し、TCEP-HClを0.9 Mトリス塩基(pH 8.8)に溶解します。pHインジケーターストリップを使用して、125 mM TCEP-HCl溶液(中性)のpHを試験し、トリスベース(pH 8.8)でpHを調整します。
    1. 200 μL OVAタンパク質溶液(0.5 mgのOVAを含む)を1.5 mLの滅菌チューブにピペットで移します。240 μl の 125 mM TCEP-HCl と 560 μL の滅菌超純水をピペットで OVA タンパク質に加え、最終濃度が 0.5 mg/mL の OVA タンパク質と 30 mM の TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl)
      注:2.5 mgのEndoGrade OVA(凍結乾燥)を1 mL PBSに溶解して、2.5 mg / mLのOVA溶液を生成します。.
    2. 得られたOVA/TCEP-HClを室温で1.5時間
      インキュベートします。 手記：このインキュベーションステップを延長しないでください。
  2. αDEC-205を結合用に活性化するには、2 mgのスルホ-SMCCを100 μLの超純水に溶解します
    手記：スルホ-SMCCは加水分解を受けやすいです。したがって、大量の未溶解スルホ-SMCCを迅速に処理するか、利用可能な2 mgアリコートを使用する必要があります。.
    1. αDEC-205をPBSで希釈し、900μLに2.5mgが含まれるようにします。
    2. 2.5 mgのαDEC-205(容量900 μL、ステップ3.2.1で取得)と100 μLのスルホ-SMCC(ステップ3.2で取得)を1.5 mLチューブで混合し、合計容量を1 mLにします。
    3. αDEC-205/sulfo-SMCC溶液を加熱ブロック内で37°C、550rpmで30分間インキュベー
      4. トします。
  3. これらのインキュベーション後、脱塩カラム(MWCO 7 kDa、カラム容量5 mL)を使用して、過剰なsulfo-SMCCおよびTCEP-HClを溶液から直ちに除去します。
    1. カラム(MWCO 7 kDa)の底部クロージャーをひねり、キャップを緩めて、カラムを15 mLのコニカルチューブに入れます。
    2. 室温で1,000 x gで2分間遠心分離し、液体を除去します。
    3. カラムを新しいチューブに入れ、キャップを取り外します。抗体/スルホ-SMCCとOVA/TCEP-HClをそれぞれ1カラムのコンパクトなレジンベッドの中心にゆっくりとロードします。
    4. 1,000 x g、室温で2分間遠心分離します。
    5. 使用後は列を廃棄してください。標識のためにプライミングされた抗体とOVAを含む溶液はチューブ内にあります。
    6. 直ちにピペッティングで両溶液を混合し、αDEC-205とOVAを結合します。
    7. 得られたαDEC-205とOVAの混合物を4°Cで一晩インキュベー
      8. トします。
  4. 標識後、過剰な未結合OVAを溶液から除去し、遠心タンパク質濃縮器(MWCO 150 kDa)を使用して結合したαDEC-205/OVAを濃縮します。
    1. 遠心タンパク質濃縮器(MWCO 150 kDa)をカラム上で12 mLのPBSをピペッティングし、室温で2,000 x gで2分間遠心分離することにより、予備すすぎます。
      手記：必要に応じて、約5 mLの容量がカラムを通過するまで、遠心分離ステップ(3.4.1.)を繰り返します。
    2. αDEC-205/OVAを遠心タンパク質濃縮器にロードする前に、ウェスタンブロット分析用に未濃縮αDEC-205/OVAのサンプル20 μLを保存してください。このアリコートは分析まで4°Cで保存してください。
    3. αDEC-205/OVAをピペッティングで遠心式タンパク質濃縮器にロードします.
      手記：遠心濃縮器の上部チャンバーのベッドとの接触を避けてください。
    4. 濃縮器をPBSで15 mLまで満たし、濃縮器を室温で2,000 x gで5分間遠心分離します。
    5. フロースルー(フロースルーI)のサンプルをウェスタンブロット解析用に保存し、残りのフロースルーを廃棄します。
    6. 濃縮器をPBSで10mLまで満たし、濃縮器を室温で2,000 x gで少なくとも8分間遠心分離します。
    7. ウェスタンブロット解析のために2回目のフロースルー(フロースルーII)のサンプルを保存し、残りのフロースルーを廃棄します。
    8. 目的の濃縮が達成されたら(約1.5 mLのαDEC-205/OVA溶液を上部チャンバーに残す必要があります)、濃縮されたサンプルを穏やかに吸引します
      手記：上部チャンバーに液体が多すぎる場合は、遠心分離を繰り返すことができますが、できるだけ短く保つ必要があります。
  5. 得られたαDEC-205/OVAのタンパク質濃度を、微量分光光度計を用いて測定します。PBS をブランクとして使用します。
  6. αDEC-205/OVAを0.22μmシリンジフィルターユニットでろ過します.
    手記：その後の分析やin vivo実験のために、αDEC-205/OVAは4°Cまたは-18°Cで保存できます。

4. ELISAによる化学結合の検証

  1. ELISAを実施して、αDEC-205/OVAに導かれる化学結合の成功をさらに検証します。
  2. コーティングバッファー(0.1 M重炭酸ナトリウム(NaHCO3)pH 9.6、H2Oで希釈)に3 ng/μLのウサギαOVA抗体100 μL/ウェルを適切な96ウェルELISAプレートでコーティングします。
    1. プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
  3. コーティング後、プレートをPBSで3回洗浄します(ELISAワッシャーなどを使用)。
  4. プレートの各ウェルに200 μLのブロッキングバッファー(PBS中の10% FCS)をピペッティングしてプレートをブロックし、プレートを室温で30分間インキュベー
    5. トします。
  5. αDEC-205/OVA (ステップ 3.6 から取得) をブロッキングバッファー (PBS 中の 10% FCS) で 1:2 の段階希釈を行い、6 μg/mL から 93.8 ng/mL までの希釈値を得るための αDEC-205/OVA を取得し、これらの減少量の αDEC-205/OVA を 100 μL/ウェルでウェルに加えます。
    1. プレートを室温で1時間インキュベートします。
  6. プレートをPBSで3回洗浄します(ELISAワッシャーなどを使用)。
  7. ヤギαrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO抗体(ブロッキングバッファー(PBS中10%FCS)で1:2,000に希釈)をプレートの各ウェルに100 μL加えます。
    1. 室温で1時間インキュベートします。
  8. プレートをPBSを使用して3回洗浄します(例:ELISAワッシャーを使用)。
  9. 50 μLのHRPO基質をウェルに加えます。明確な色反応が観察される場合は、ウェルあたり150μlの停止溶液(1M H2SO4)を添加して反応を停止します。
  10. 5分後、ELISAリーダーを使用して450nmで吸収を読み取ります。

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブロッキングバッファ(ELISA)PBS中の10 % FBS
細胞培養用フラスコ T25グライナーバイオワン690175標準的なCELLSTARフィルターキャップ細胞培養フラスコを使用しますが、懸濁培養フラスコ(690195)を使用します
細胞培養用フラスコ T75グライナーバイオワン658175標準的なCELLSTARフィルターキャップ細胞培養フラスコを使用しますが、懸濁培養フラスコ(658195)を使用します
細胞培養用フラスコ T175グライナーバイオワン661175標準的なCELLSTARフィルターキャップ細胞培養フラスコを使用しますが、懸濁培養フラスコ(661195)を使用することもできます
遠心濃縮器 MWCO 10 kDaザルトリウスVS2001ビバスピン20遠心濃縮器
遠心タンパク質濃縮器 MWCO 100 kDa, 5 - 20 mlサーモフィッシャーサイエンティフィック88532Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (カタログ番号 89921) を使用していますが、これは現在販売されていません
遠心分離ボトルナルゲン〒525-2314PPCO(ポリプロピレン共重合体)とPP(ポリプロピレン)スクリューキャップ付き、500 ml、ドイツのVWRから入手
コーティングバッファー(ELISA)0.1 M 重炭酸ナトリウム (NaHCO3) 含有 H2O (pH 9.6)
脱塩カラム MWCO 7 kDaサーモフィッシャーサイエンティフィック89891Thermo Scientific Zebaスピン脱塩カラム、7K MWCO、5 mL
検出試薬ELISA(HRPO基質)シグマ・アルドリッチ/メルクT8665-100ミリリットル3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB)液体基質システム
ELISA 96ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック442404MaxiSorp Nunc-Immuno
ウシ胎児血清パンバイオテック品番40-47500FBSグッドフォルテ
ISF-1ミディアムバイオクロム/バイオスイステックファックス 9061-01
NLDC-145ハイブリドーマATCCのHB-290まだ手元にない場合は、ハイブリドーマ細胞をATCCから取得できます
オボアルブミンHyglos (BioVendor経由)321000EndoGrade OVA ウルトラピュア <0.1 EU/mg
ペニシリン/ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック15140122Gibco ペニシリン/ストレプトマイシン 10.000 U/ml; あるいは、Gibco ペニシリン/ストレプトマイシン 5.000 U/ml (15070-063) を使用することができます
PETGポリエチレンテレフタレートグリコール細胞培養ローラーボトルNunc In Vitro (英語〒734-2394標準PDLコーティング、通気口(1.2倍)、1050 cm²、容量100 - 500 ml、ドイツのVWRから取得
pH指示薬ストリップメルク109535pHインジケーターストリップ0-14
ポリクローナルヤギαrat-IgG+IgM-HRPO抗体 (ELISA)ジャクソン免疫研究 〒112-035-068ドイツのディアノバから取得、1:2000でELISAに使用
ポリクローナルウサギαOVA (ELISA)アブカムab1816883 ng/μlで使用
プロテインGセファロースカラムメルク/ミリポアP32965 mL の Protein G セファロース、Fast Flow を空のカラム PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) に充填します。
ラバープラグオムニラボ5230217DEUTSCH & NEUMANN ラバーストッパー (下 Φ 17 mm、上 Φ 22 mm)
シリコンチューブオムニラボ5430925DEUTSCH & NEUMANN (内側 Φ 1 mm、外側 Φ 3 mm)
スリムファスト私たちは、この西洋のしみのアプローチでは、粉乳よりも良い結果をもたらしたため、薬局で自由に入手できる通常のスリムファストチョコレートを使用しました
停止ソリューション(ELISA)1M H2SO4
スルホ-SMCCサーモフィッシャーサイエンティフィック22322さんPierce Sulfo-SMCC Cross-Linker;またはカタログ番号 A39268(10 x 2 mg)を使用してください
シリンジフィルターユニット 0.22 μm メルク/ミリポアSLGV033RSMillex-GV シリンジフィルターユニット、0.22 μm、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌済み
シリンジ10 mlオムニラボ使い捨てシリンジ Injekt® Solo B.Braun
ステリカン®カニューレB.ブラウンステリカン® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; 黄色
TCEP-HClのサーモフィッシャーサイエンティフィックA35349 の
チューブコネクタオムニラボKleinfeldミニチュアチューブコネクタ、シリコンチューブ用
プレート ) 型

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ELISA DEC 205

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