化学共役抗体-抗原コンジュゲートを検証するための酵素結合免疫吸着アッセイ

要約

出典:Volckmar, J. et al., Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)技術による化学的に結合した抗体-抗原複合体の検出を示しています。捕捉された抗体は、抗体-抗原複合体の抗原の特異的エピトープに結合し、後で酵素結合二次抗体を用いて可視化することができます。

プロトコル

1. ハイブリドーマ細胞株NLDC-145からのαDEC-205の作製

1. 抗体産生のためには、凍結保存したNLDC-145細胞をαDEC-205を産生する細胞を水浴中で37°Cで解凍します。セルを37°Cおよび5%CO₂で増殖させます。抗体産生に進むには、75 cm² ボトルが 2 本必要になります。細胞培養手順は、安全な作業条件を確保し、培養物の汚染を防ぐために、安全キャビネット内で実行する必要があります。
   1. 解凍した細胞1 mL(1 x 10⁶ - 5 x 10⁶細胞/mL)を、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに予熱)を添加したISF-1培地9 mLに1 mLを細胞培養フラスコ(25 cm²)に再懸濁します。フラスコを37°C、5%CO₂の細胞培養インキュベーターに水平に置きます。
   2. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で、70%コンフルエントになるまで培養します。これは通常、24〜48時間後に達成する必要があります。
   3. 細胞が70%コンフルエントになったら、1〜10 mLの容量範囲のピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、完全なNLDC-145細胞懸濁液(10 mL)を15 mLの円錐形遠心チューブに移します。細胞を250 x gで遠心分離し、室温で10分間....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブロッキングバッファ(ELISA)			PBS中の10 % FBS
細胞培養用フラスコ T25	グライナーバイオワン	690175	標準的なCELLSTARフィルターキャップ細胞培養フラスコを使用しますが、懸濁培養フラスコ(690195)を使用します
細胞培養用フラスコ T75	グライナーバイオワン	658175	標準的なCELLSTARフィルターキャップ細胞培養フラスコを使用しますが、懸濁培養フラスコ(658195)を使用します
細胞培養用フラスコ T175	グライナーバイオワン	661175	標準的なCELLSTARフィルターキャップ細胞培養フラスコを使用しますが、懸濁培養フラスコ(661195)を使用することもできます
遠心濃縮器 MWCO 10 kDa	ザルトリウス	VS2001	ビバスピン20遠心濃縮器
遠心タンパク質濃縮器 MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (カタログ番号 89921) を使用していますが、これは現在販売されていません
遠心分離ボトル	ナルゲン	〒525-2314	PPCO(ポリプロピレン共重合体)とPP(ポリプロピレン)スクリューキャップ付き、500 ml、ドイツのVWRから入手
コーティングバッファー(ELISA)			0.1 M 重炭酸ナトリウム (NaHCO3) 含有 H2O (pH 9.6)
脱塩カラム MWCO 7 kDa	サーモフィッシャーサイエンティフィック	89891	Thermo Scientific Zebaスピン脱塩カラム、7K MWCO、5 mL
検出試薬ELISA(HRPO基質)	シグマ・アルドリッチ/メルク	T8665-100ミリリットル	3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB)液体基質システム
ELISA 96ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno
ウシ胎児血清	パンバイオテック	品番40-47500	FBSグッドフォルテ
ISF-1ミディアム	バイオクロム/バイオスイステック	ファックス 9061-01
NLDC-145ハイブリドーマ	ATCCの	HB-290	まだ手元にない場合は、ハイブリドーマ細胞をATCCから取得できます
オボアルブミン	Hyglos (BioVendor経由)	321000	EndoGrade OVA ウルトラピュア <0.1 EU/mg
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	Gibco ペニシリン/ストレプトマイシン 10.000 U/ml; あるいは、Gibco ペニシリン/ストレプトマイシン 5.000 U/ml (15070-063) を使用することができます
PETGポリエチレンテレフタレートグリコール細胞培養ローラーボトル	Nunc In Vitro (英語	〒734-2394	標準PDLコーティング、通気口(1.2倍)、1050 cm²、容量100 - 500 ml、ドイツのVWRから取得
pH指示薬ストリップ	メルク	109535	pHインジケーターストリップ0-14
ポリクローナルヤギαrat-IgG+IgM-HRPO抗体 (ELISA)	ジャクソン免疫研究	〒112-035-068	ドイツのディアノバから取得、1:2000でELISAに使用
ポリクローナルウサギαOVA (ELISA)	アブカム	ab181688	3 ng/μlで使用
プロテインGセファロースカラム	メルク/ミリポア	P3296	5 mL の Protein G セファロース、Fast Flow を空のカラム PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) に充填します。
ラバープラグ	オムニラボ	5230217	DEUTSCH & NEUMANN ラバーストッパー (下 Φ 17 mm、上 Φ 22 mm)
シリコンチューブ	オムニラボ	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (内側 Φ 1 mm、外側 Φ 3 mm)
スリムファスト			私たちは、この西洋のしみのアプローチでは、粉乳よりも良い結果をもたらしたため、薬局で自由に入手できる通常のスリムファストチョコレートを使用しました
停止ソリューション(ELISA)			1M H2SO4
スルホ-SMCC	サーモフィッシャーサイエンティフィック	22322さん	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker;またはカタログ番号 A39268(10 x 2 mg)を使用してください
シリンジフィルターユニット 0.22 μm	メルク/ミリポア	SLGV033RS	Millex-GV シリンジフィルターユニット、0.22 μm、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌済み
シリンジ10 ml	オムニラボ		使い捨てシリンジ Injekt® Solo B.Braun
ステリカン®カニューレ	B.ブラウン		ステリカン® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; 黄色
TCEP-HClの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A35349 の
チューブコネクタ	オムニラボ		Kleinfeldミニチュアチューブコネクタ、シリコンチューブ用

プレート ) 型