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1. コメットアッセイ用材料の準備
- 顕微鏡スライドの準備
- 50 mLチューブとマイクロ波でアガロースをddH2Oに溶解するために、1%(w / v)の通常の融点アガロース[二重蒸留水(ddH2O)に溶解]を注ぎます。固化が発生した場合は、廃棄して新たに準備してください。
- 顕微鏡スライドをプレコートするには、1%(w/v)の正常融点アガロースを含む50 mLチューブにスライドを浸します。
- スライドを浸した後、スライドの裏側をすばやく拭いてください.
手記： スライドの裏側を適切に拭かないと、顕微鏡による分析ステップ中にスライドのバックグラウンドノイズが増加します。
- コーティングされたスライドに、つや消しセクションの右下隅に油性マーカーでラベルを付けます(図1A)。これは、スライドのどちら側が事前にコーティングされているかを示しています。
- アガロースを固め、室温で一晩乾燥させます。
- 乾燥させたスライドをティッシュペーパーで包み、箱に入れて保管します。
2. サンプルの準備
- 培養細胞
手記： まず、コメットアッセイを開始する前に、細胞を損傷剤で処理します。次に、次の手順を実行します。
- 細胞が接着している場合は、細胞をトリプシン化して、細胞の適切なコンフルエンシーで細胞培養フラスコまたは細胞培養ペトリ皿から細胞を放出します。血清含有培地を添加してトリプシンを中和します。.
- 細胞を50 mLチューブに移し、遠心分離(HaCaTsの場合は、室温で300 x gで5分間遠心分離)し、上清を静かに除去し、細胞ペレットにPBS1 mLを加えます。
- 細胞カウントを行います。
- 30,000個の細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、7,607 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- コメットアッセイを行う前に、上清を静かに取り除き、細胞ペレットを暗闇の氷上に保管します
手記：コメットアッセイを実施する前に、細胞のマイコプラズマ汚染を定期的に検査して、報告されているように、人工DNA損傷の形成やDNA損傷応答の変化などの影響を防ぐ必要があります。遠心分離条件は、使用する細胞の種類に応じて、必要に応じて変更することができます。
- 修復アッセイのための培養細胞の調製
- 細胞培養フラスコまたはペトリ皿で細胞を培養します。
- 細胞を損傷剤で処理する前に、細胞を1mLのPBSで2回洗浄します(例:BE-M17細胞の場合、50μMのH2O2で20分間処理します)処理中に修復が起こらないようにします。
- 細胞を1mLのPBSで2回優しく洗浄し、残留する損傷物質を取り除きます。
- 細胞培養培地を再導入し、加湿インキュベーター(37°C、5%CO2)で細胞をさまざまな期間(0分、30分、2時間、6時間、24時間、30時間など)修復します。
- 各時点で、30,000個の細胞を10%ジメチルスルホキシド(DMSO)含有細胞培養培地に収集し、-80°Cで保存します。
- コメットアッセイを行う前に、細胞を水浴中で37°Cで迅速に解凍し、7,607 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、アッセイを実施する前(つまり、ステップ3から)に細胞ペレットを氷上に保存してください。
3. 細胞溶解
>注:氷上ですべての手順を実行してください。
- 12,000個の細胞またはゲルあたり2.5μLの全血を使用してください。
- 0.6%(w/v)の低融点アガロースをPBSに溶かしたものをマイクロ波で調製し、固化を防ぐために37°Cの水浴に入れます。
- プレコートされたスライドのつや消しの端に、油性マーカーまたは鉛筆を使用して、研究者の名前、日付、および治療情報にラベルを付けます。
- 平らなベンチに冷却プレートを置き、2つの凍結冷却パックを金属表面の下のスライド引き出しに挿入します(図2を参照)。
- スライドを冷却プレートに置き、スライドを1〜2分間予冷してから、0.6%(w / v)の低融点アガロース含有細胞を追加します><。
手記：スライドを冷却プレートに1〜2分以上放置すると、周囲の湿度によりスライド表面に結露が発生する可能性があります。これにより、低融点のアガロースゲルがスライド上での安定性が低下する可能性があります。
- ペレットをボルテックスで分散させます(ステップ2.2.7)。ペレットからすべての上清が取り除かれたことを確認します。サンプルチューブ(ペレット化した細胞を含む)をすぐに氷上に戻します.
手記： サンプル含有チューブを遠心分離機に入れるときは、ペレットがチューブのこちら側に回収されるように、ヒンジを外側に向けて置きます。ペレットが見えにくい場合があり、上澄み液を取り除いた状態でペレットを剥がすのは簡単です。チューブの蓋をこの向きにして遠心分離すると、細胞ペレットがどこにあるかを知ることができます。
- 細胞ペレットを0.6%低融点アガロース(LMPアガロース)200μLで再懸濁し、気泡を作らずにピペッティングで上下に混合します。次に、80 μLのLMPアガロース含有細胞を冷却スライド上に素早く移し、カバースリップをゲルに素早く置きます。
- ジェルをチリングプレートに1〜2分間セットします。
- その間に、500 mLの溶解バッファーの作業溶液(表1)を調製し、溶解皿(図3)に注ぎます。
- ゲルをセットしたら、スライドを親指と人差し指でそっと持ち、カバーガラスをゲルからスライドさせて、カバーガラスをすばやく取り外します。
- サンプルを含むスライドをスライドキャリア内に置き(スライド上のすべての黒い「ドット」マークをキャリアに配置するときは同じ方向を向く必要があります)(図1B)、次にスライドキャリアを溶解皿の内側に置きます(図3)。
- 溶解皿の蓋を閉め、分解皿を冷蔵庫で一晩4°Cまたは室温で30分間、オペレーターのタイムスケジュールに最も適
した状態に保ちます。
4. 電気泳動
- スライドキャリアを溶解皿から慎重に取り外します。ゲルを乱さないように注意してください。
- 氷冷したddH2Oをあらかじめ装填した洗濯皿にスライドキャリアをそっと置き、スライドがddH2Oで完全に覆われていることを確認して30分間放置します。
- 電気泳動タンクの下のスライド式引き出し内に凍結冷却パックを挿入して、最適な緩衝温度を維持します。
- 氷冷電気泳動作業溶液(表1)を電気泳動タンクに慎重に追加し、スライドキャリアを電気泳動タンクに移します。細胞含有ゲルを含む透明な部分(つまり、つや消し/ラベリング端ではない)がカソード(赤色電極)を指すようにスライドを向けます。
- スライドを電気泳動タンクに20分間置いて、DNAがリラックスしてほどけるようにします。この手順では、電源をオフにしてください。
- 必要に応じて、新しい冷凍冷却パックを挿入して、冷却を最大化します。
- 1.19 V/cm、または最適化された条件で20分間電気泳動を行います
手記：電気泳動の実行条件とバッファーの量の最適化は、すべてのラボで推奨されます。電気泳動中にスライドキャリアを1つだけ使用しても、スライドが電気泳動バッファーの抵抗に影響することはなく、スライドの数を変更しても電圧や電流に大きな影響は見られませんでした。
- 電源を切り、スライドキャリアを電気泳動タンクから慎重に取り外し、ティッシュペーパーで30秒間水気を切るのを待ちます。
- スライドキャリアを中和バッファー(表1)の入った皿に入れます。20分間放置します。
- スライドキャリアを中和皿から取り出し、氷冷したddH2Oが入った洗濯皿に入れ、20分間放置します。
- スライドキャリアを水から取り出し、オペレーターのスケジュールに応じて、スライドをインキュベーターで37°Cで1時間乾燥させるか、室温で一晩乾燥させるか、乾燥させないでください。
手記：ステップ4.11で乾燥がない場合は、ステップ5.2の染色ステップを行ってください。
5. ヨウ化プロピジウム(PI)染色
- スライドキャリアを氷冷したddH2Oが入った洗濯皿に移してスライドを再水和し、30分間放置します。
- スライドキャリアを2.5 μg/mLのヨウ化プロピジウム溶液を含む染色皿に入れます
手記：ヨウ化プロピジウムは光に弱いので、暗い場所で取り扱ってください。また、毒性もあります。
- 染色皿の蓋を閉め、室温で暗所で20分間インキュベー
トします。
- スライドキャリアを別の皿に移し、氷冷したddH2Oで20分間洗います。
- スライドキャリアをディッシュから取り外し、オペレーターのスケジュールや好みに応じて、37°Cのインキュベーターまたは室温で暗所で完全に乾燥させます。
- スライドが完全に乾いたら、スライドキャリアからスライドを取り出し、画像分析の準備が整うまで暗闇のスライドボックスに保管します。
手記： スライドは無期限に読み取り可能で、必要に応じて再染色することができます。
6. コメットのスコアリングとデータ解析
>注:「彗星」という用語は、アッセイが行われた後に顕微鏡で見たときの損傷した細胞の画像に由来します(図4)。電気泳動条件下では、損傷を受けていない細胞のDNAは、ほとんど移動せず、彗星「ヘッド」と呼ばれる回転楕円体に留まります。しかし、鎖切断の存在により、細胞のDNAがヘッドから移動して「尾」を形成し、彗星のような外観になります(図4)。尾部のDNAが多ければ多いほど、より多くの損傷が存在します。
- PI(赤)フィルター(λ = 536/617 nm)とコメットアッセイスコアリングソフトウェアを使用して蛍光顕微鏡の電源を入れます。
- パスツールピペットを使用してゲルに水を一滴加え、カバースリップで覆います。
- スライドを蛍光顕微鏡に入れ、彗星を「スコアリング」します
手記： スコアリングは、各彗星に存在する損傷の量を決定するために、彗星を評価する手段です。大まかに言えば、これは、ユーザーの選択した好みに応じて、目(0から4のスケールで彗星のサイズを測定する)または自由に使用するか、または市販のソフトウェア30を使用するかのいずれかの2つのアプローチを使用することによって達成することができる。一般に、どちらのアプローチも彗星の尾のサイズを評価しますが、彗星に関連するさまざまなエンドポイントを決定できます。ソフトウェアを使用している場合は、彗星の雲頭の中央をクリックし、ソフトウェアが彗星を自動的に検出するまで待ってから、選択したエンドポイントを評価します(図4)。
- ゲルあたり50個のコメット、サンプルあたり100個のコメットをスコアリングします(つまり、各サンプルが異なるDNA損傷処理に対応するか、それらの複製に対応します)。
- 実験を反復 (n = 2) するか、実験を 3 倍にします (n = 3)。
手記： n=2回の反復実験のみを行うと統計解析は行えませんが、n=3の場合はダゴスティーノ正規性検定を行います。ほとんどのコメットアッセイデータは正規性検定に合格しません。この場合は、ノンパラメトリック検定 (Dunn の多重比較検定による Kruskal-Wallis 検定と、p < 0.05 に設定された Mann-Whitney 検定の有意性) を使用します。
)
します。
| 試薬 | ストックソリューション | 実用的な解決策 |
| 溶解バッファー | 100 mM Na2EDTA、2.5 M NaCl、および 10 mM Tris 塩基 (ddH2O) 中; 10 M NaOH で pH を 10 に調整 | 1% Triton X-100 溶解ストック溶液 |
| 電気泳動バッファー | 10 M NaOH および 200 mM Na2EDTA (ddH2O 中 | 300 mM NaOH および 1 mM Na2EDTA; pH > 13 |
| 中和バッファー | 0.4 M Tris 塩基 (ddH2O) で、HCl で pH を 7.5 に調整 | |
| 染色バッファー | 1 mg / mLヨウ化プロピジウム | 2.5 μg/mL ヨウ化プロピジウム含有 ddH2O |
>表1:ハイスループットアルカリコメットアッセイ(HTP ACA)で使用される試薬の組成。溶解、電気泳動、中和、および染色バッファーのストック濃度と使用濃度が示されています。
