アミノ酸の細胞内取り込みを定量するための放射性標識アミノ酸取り込みアッセイ

要約

出典:Shen, L., et al. Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、骨髄由来の間質細胞によるアミノ酸の取り込みを推定するためのin vitro技術を示しています。Na⁺依存性アミノ酸トランスポーターは、細胞内での放射性標識アミノ酸の取り込みを媒介し、その放射能を測定することで細胞への取り込みを推定します。

プロトコル

放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前承認が必要です。

1. 細胞内でのアミノ酸の取り込み

1. 12ウェル組織培養プレートの各ウェルに5 x 10⁴個のST2細胞をプレートします。10% FBS、100 U/mL ペニシリン、および 0.1 μg/mL ストレプトマイシン (Pen/Strep) を含む α-MEM のプレートセル。ステップ1.12のノーマライゼーションの条件ごとの細胞数を定量化するために、細胞の追加ウェルをプレート化します。加湿細胞培養インキュベーターで細胞を37°C、5% CO₂でインキュベー
トします。
2. コンフルエントになるまで細胞を2〜3日間培養します。
3. 実験当日は、以下の溶液を調製します:1x Phosphate Buffered Saline (PBS)、pH 7.4 および Krebs Ringers HEPES (KRH) buffer、pH 8.0: (120 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、NaHCO₃、5 mM HEPES、1 mM D-Glucose)。37°Cまで予温します。
4. 培地を吸引し、1x PBS(pH 7.4.
   1 mL)で細胞を2回洗浄します 手記：このプロトコールは、非コンフルエントな細胞を迅速に分裂させるのにも適しています。この場合、放射能を絶対細胞数またはDNA含有量のいずれかに正規化することが重要です。さらに、培養プレートまたはフラスコのサイズを大きくして、全体の細胞数とcpmの値を増やすことを検討してください。これは、個別に経験的に決定することが重要です。
5. 1x PBSを吸引し、細胞を1mLのKRHで1回洗浄します。
6. KRH.
   1 mL あたり 4 μL の [1 μCi ^μL-1] L-[3,4-3 H]-グルタミンストックを希釈して、4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-グルタミン作動培地を作製します 手記：放射性物質を使用する前に、所属機関の放射線安全室に連絡し、承認を受けてください。放射線に関連するすべての手順は、プレキシガラスシールドの背後で実行する必要があります。
7. 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-グルタミン作動培地を含む0.5 mLのKRHと細胞を5分間インキュベートします。
8. 放射性媒体を収集し、廃液容器に分注します。細胞を氷冷したKRHで3回短時間洗浄し、反応を終了します。放射性廃液容器に洗浄した洗剤をすべて集めて捨てる。
9. 1 mLの1% SDSを各ウェルに加え、10倍に漸増して細胞を溶解し、均質化します。細胞ライセートを1.5 mLチューブに移します。細胞培養プレート、血清ピペット、ピペットチップは固形放射性廃棄物容器に捨ててください。
10. >10,000 x gで10分間遠心分離し、上清を8 mLのシンチレーション溶液を含むシンチレーションバイアルに移します。シンチレーションバイアルを激しく振って混ぜます。チューブとピペットチップは固形放射性廃棄物容器に捨ててください。
11. シンチレーションカウンターを使用して、放射能を1分あたりのカウント数(cpm)で読み取ります。シンチレーションバイアルはシンチレーションバイアル廃棄物容器に廃棄します。
12. 細胞の残りの非放射性プレートから細胞をトリプシン化し、再懸濁し、カウントします(ステップ1.1を参照)溶解した放射性培養物中の細胞数を推定します。血球計算盤を使用して、各実験条件の非放射性ウェルあたりの細胞数をカウントします。ステップ 1.11 の cpm を、非放射性プレートからの推定セル番号に正規化します。
13. 実験終了後、細胞培養フード、ベンチ、およびすべての器具を放射能除染スプレーで除染します。最後に、ワイプテストを実行して、作業領域が放射線を受けていないことを確認します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25%トリプシン	ギブコ	25200
12ウェルプレート	コーニング	3513
ベックマンLS6500シンチレーションカウンター
塩化カルシウム	シグマ	C1016
塩化コリン	シグマ	C7077
D-(+)-グルコース溶液	シグマ	G8769
DPBSの	ギブコ	14190
HEPES(1M)	ギブコ	15630
L-[3,4-3H(N)]-グルタミン	パーキンエルマー	NET551250UC
液体シンチレーションバイアル	シグマ	Z190535
塩化リチウム溶液、8M	シグマ	L7026
塩化マグネシウム	シグマ	M8266
MEMα	ギブコ	12561
微量遠心チューブ 15mL	バイオティクス	89511-256
塩化カリウム	シグマ	P3911
炭酸水素ナトリウム	シグマ	S6014
塩化ナトリウム	シグマ	S9888
ドデシル硫酸ナトリウム	シグマ	436143
ウルティマゴールド(シンチレーション溶液)	パーキンエルマー	6013329
α-(メチルアミノ)イソ酪酸	シグマ	M2383

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