線虫の細胞分画中のピルビン酸レベルを推定するためのピルビン酸アッセイ

要約

出典:柳瀬、S.他線虫Caenorhabditis elegansにおける細胞内乳酸およびピルビン酸の小規模比色アッセイ。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、線虫Caenorhabditis elegansの細胞画分のピルビン酸を定量的に測定するための比色アッセイについて説明しています。ピルビン酸オキシダーゼと細胞ピルビン酸との酵素反応から生成される過酸化水素を利用して、発色性染料を酸化して着色物を生成し、比色法を使用してピルビン酸濃度を決定します。

プロトコル

1. 線虫のシンクロナイズドカルチャー

1. 播種する前に、大腸菌(E.coli)株OP50を37°Cで300mLのLuria-Bertani(LB)ブロス液培地で一晩培養します。培養したOP50は-4°Cで保存してください。
   1. LBブロス液培地を作るには、トリプトン10 g、酵母抽出物5 g、NaCl 10 g、および1 N NaOH1.5 mLを使用し、脱イオン水で1 Lに加えます。オートクレーブ.
      手記：OP50およびC.エレガンス株は、Caenorhabditis Genetics Center(ミネソタ大学、米国ミネソタ州セントポール)から入手できます。
2. 線虫増殖培地(NGM)寒天培地を作るには、NaCl 3 g、ペプトン 2.5 g、寒天 17 g、および脱イオン水 975 mL を使用します。オートクレーブ。55°Cに冷却した後、1 mLの1 M MgSO₄、1 mLの1 mLの1 M CaCl₂、1 mLの5 mg/mLコレステロールをEtOHに、および25 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)を90 mmシャーレに順番に滅菌して加えます。
   1. 1 Mリン酸カリウムpH 6.0の場合、108.3 gのKH₂PO₄および46.6 gのK₂HPO₄を使用し、1 L.オートクレーブに脱イオン水を加えます。
3. 培養したOP50をNGM寒天プレートに1〜2mL広げます。OP50の薄層を作るには、線虫を添加する前に、プレートを室温で一晩インキュベートします
   手記：OP50を接種したNGM寒天プレートは、室温で2〜3週間保存できます。
4. OP50を入れたNGM寒天プレートに少なくとも100匹の線虫を加え、成虫期まで20°Cで培養します。少なくとも3枚のプレートが必要です。
5. 子宮内で卵を採取するには、3つのNGM寒天プレートから妊娠した雌雄同体を、それぞれ5 mLのSバッファーと共に15 mLのコニカルチューブに移し、300 x gで室温で30秒間遠心分離して、15 mLのSバッファーで3回ワームを洗浄します。
   1. Sバッファーを作製するには、5.9 gのNaClと50 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)を使用し、脱イオン水で1 Lに加えます。オートクレーブ。
6. 寄生虫をアルカリ性次亜塩素酸塩溶液(0.5 mLの新鮮な漂白剤または同等物:5〜6%次亜塩素酸ナトリウム、0.1 mLの10 M NaOH、約4.5 mLのS緩衝液)に溶解し、溶液を室温で10〜15分間静置し、反転して混合します
   手記：15分以内に、成虫は溶解し、死体から解放された卵のかすんだ溶液が残ります(解放された卵は実体顕微鏡を使用して確認する必要があります)。0.1 mLの10 N NaOHの代わりに、0.2 mLの5 N NaOHも使用できます。
7. 次亜塩素酸塩処理後、卵ペレットを15mLのSバッファーで3回洗浄し、5〜6mLのSバッファーに再懸濁します。L1期幼虫の年齢同期培養のために、大腸菌を含まないSバッファーで20°Cで一晩インキュベーション中に放出された卵を孵化させます。
8. L1期の幼虫のおおよその数を決定するには、幼虫を少なくとも3回再懸濁した後、10 μLのSバッファー中の線虫を実体顕微鏡でカウントし、平均を計算します。次に、L1期の幼虫をOP50(90mmシャーレを使用してプレートあたり1,500〜3,000匹の線虫)を含む5枚のNGM寒天プレートに移し、20°Cで培養し、自家受精が始まり、数個の卵が産まれる若成体期まで成長します(通常は3日後)。

2. C. elegansからの細胞画分の抽出

1. 若年成人期(生後5日齢)の寄生虫を、Sバッファーを含む5つのNGM寒天プレートから採取します(図1A)。
   1. 30%(w/v)スクロースへの浮選にスクロース法6を使用して生きている線虫のみを選択するには、3〜4 mLのSバッファーに懸濁した線虫と等量の氷冷した60%(w / v)スクロースを15 mLの円錐管に混合します。チューブを1,500 x gで15秒間、4°Cで回転させ、浮遊するワームをパスツールピペットでチューブの壁から移動させて新しいチューブに移します。
2. 1,500 x g、4°C、30秒間遠心分離することにより、Sバッファーで3回ワームを洗浄し、1,000 μLマイクロピペットチップを使用して、遠心分離後の洗浄済みワームの湿潤量を確認します(図1B)。
3. 洗浄した線虫を等量の氷冷した10%(w / v)トリクロロ酢酸(TCA、最終濃度5%)に加えてタンパク質を沈殿させます(図1C)。TCAの代わりに、過塩素酸(PCA)またはメタリン酸を使用できます。
4. テフロンホモジナイザー(Potter-Elvehjemティッシュグラインダー)で40ストロークの乳棒を使用して、氷上で最大1,300rpmで回転させて、ワームを沈殿物で均質化します。
5. ホモジネートをパスツールピペットで新鮮な1.5mLマイクロチューブに移し、超音波ホモジナイザーを使用して氷上で20%のデューティサイクルで3分間(1分間の3回)超音波処理します。
6. 8,000 x gで4°C、10分間遠心分離してホモジネートを清澄化し、上清を4 M KOH(0.25容量から10%TCA)で氷上で20分間中和し、8,000 x gで4°Cで10分間遠心分離します。上清(試験サンプルとして)は、次のアッセイまで-80°Cで保存できます。

3. 比色アッセイキットを使用したピルビン酸アッセイ

1. 比色アッセイキット(材料表)を使用して、上清(試験サンプル)中のピルビン酸の濃度を測定します。テストサンプルの二重検査を実施します。10 μLの試験サンプルと90 μLのワーキング試薬(キットに付属の94:1のEnzyme MixおよびDye Reagentを含む)を96ウェルプレートに加え、サンプルを光から保護しながら室温で30分間インキュベー
トします。
2. マイクロプレートリーダーを使用して、570 nmで各ウェルの吸光度を測定します。
3. ピルビン酸標準曲線をプロットします。ピルビン酸標準曲線から試験サンプルのピルビン酸濃度を計算します。

結果

図 1.細胞代謝産物の抽出のためのプロセス。(A)1,500-3,000匹の線虫をNGM寒天プレート(90mmシャーレ)に載せた。5枚のプレート上の線虫からの抽出は、比色分析には十分でした。(B)5枚のプレートから採取された3,000枚、1,500枚のプレートから採取されたワームは、パネルの左側と右側にそれぞれ表示されています。各 15 mL チューブの湿潤容量は両方とも 0.5 mL <、検出には十分でした。(C)線虫の均質化中に10%TCAを使用したタンパク質沈殿。ホモジナイザーで氷冷した10% TCAにワームを添加するには、ワームをホモジナイザー化する前に行う必要があります。そうしないと、比色アッセイキットを使用して細胞の乳酸とピルビン酸を試験サンプルで検出できません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
EnzyChromピルビン酸アッセイキット	BioAssayシステム	#EPYR-100	比色/蛍光100アッセイ;-20°Cで保存
トリクロロ酢酸	和光純薬	#207-04955	室温で保存
テフロンホモジナイザー	いわき/パイレックス	#358034(ウィートン)	いわき/パイレックスの代わりに、ウィートンが発売