グリコーゲン合成酵素活性を測定するための分光光度法アッセイ

要約

出典:Wilson W.A., Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、グリコーゲン合成酵素活性を推定するための分光光度法について説明しています。この方法は、NADHの吸光度が時間とともに減少することに依存しており、グリコーゲン合成酵素活性を示します。

プロトコル

1. グリコーゲン合成酵素活性の測定

1. 表1に示されているように、必要な試薬の原液を調製します(実験日の前)。
2. アッセイ当日に、4.5 mgのNADHを1.5 mLの50 mM Tris-HCl(pH 8.0)に溶解して、4 mM NADHの新鮮な作業溶液を調製します。光から保護された氷の上に保管してください。
3. UDP-グルコース、ATP、ホスホエノールピルビン酸、およびNDPキナーゼのストック溶液を氷上で解凍します。
4. ウォーターバスを30°Cに予熱します。
5. 各グリコーゲンシンターゼアッセイを1.5 mLチューブにセットするには、表2.
   に記載されている反応混合物試薬を添加します。 手記：セットアップを容易にするために、上記の各試薬を十分に含んだマスターミックスを作成し、計画されたアッセイの数を完了することができます。
6. 上記の混合物中のNADHを水で置き換えるブランク反応を準備します。使い捨てのメタクリレートキュベットに移し、これを使用して分光光度計のゼロを340nmに設定します。
7. 1.5 mLチューブに反応混合物のアリコート770 μLを1つ取ります。2 μLのNDPキナーゼと2 μLのピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ混合物を加え、穏やかに混合し、30°Cで3分間インキュベートして反応混合物を予温します。
8. グリコーゲン合成酵素を含むサンプル30 μLを20 mM Trisバッファー(pH 7.8)に添加し、混合し、反応混合物を使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
9. キュベットを分光光度計にセットし、340 nmの吸光度を10〜20分間の時間間隔で記録します。時間に対して得られた吸光度をプロットします。
   手記：NADHの非酵素的酸化を制御するために、グリコーゲン合成酵素サンプルを20 mM Trisバッファーで置換する反応を実施する必要があります。サンプルの純度によっては、他の制御反応が必要になる場合があります。
10. 反応速度を決定します。

>表1:グリコーゲンシンターゼ活性のアッセイに必要なストック溶液。

コンポーネント	道順
50 mM トリス pH 8.0	0.61 gのトリス塩基を~80 mLの水に溶解します。4°Cに冷やし、HClでpHを8.0に調整し、水で最大100mLにします。
20 mM HEPESバッファー	0.477 g の HEPES を ~ 80 mL の水に溶かします。NaOHでpHを7.0に調整し、水で容量を100mLにします。
132 mM Tris/32 mM KCl バッファー pH 7.8	1.94 gのTris塩基と0.239 gのKClを~90 mLの水に溶解します。HClでpHを7.8に調整し、水で容量を100mLにします。
0.8% w/v オイスターグリコーゲン	80 mgのカキグリコーゲンを量り、水に加えます。最終容量を水で最大10mLにし、グリコーゲンを完全に溶解するために穏やかに温めるか混ぜます。
100 mM UDP-グルコース	0.31 gのUDP-グルコースを水に溶かし、最終容量を最大1 mLにします。アリコートで保存し、-20°Cで冷凍し、数ヶ月間安定させます。
50 mM ATP	0.414 g の ATP を ~ 13 mL の水に溶解します。NaOHでpHを7.5に調整し、水で容量を15mLにします。アリコートで-20°Cに冷凍保存し、数ヶ月間安定させます。
100 mM グルコース-6-リン酸 pH 7.8	0.282 g のグルコース-6-リン酸を ~ 7 から 8 mL の水に溶かします。NaOHでpHを7.8に調整します。水で最大10mLの容量にします。-20°Cのアリコートで冷凍保存し、少なくとも6ヶ月間安定させます。
40 mM ホスホエノールピルビン酸	4 mgのホスホエノールピルビン酸を0.5 mLの20 mM HEPES緩衝液pH 7.0に溶解します。-20°Cで保存し、少なくとも1週間安定させます。
0.5 M MnCl2	9.90 gのMnCl2を最終容量の100 mLの水に溶解します。
NDPキナーゼ	凍結乾燥粉末を十分な水で再構成し、1 U/μlの溶液を生成します。アリコートを調製し、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。

>表2:グリコーゲン合成酵素活性を測定するための組成反応混合物。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名

コンポーネント	容量(μl)
160 mM Tris/32 mM KCl バッファー pH 7.8	250
水	179
100 mM グルコース-6-リン酸、pH 7.8	58
0.8 % w/v カキグリコーゲン	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-グルコース	28
40 mM ホスホエノールピルビン酸	20
0.5 M MnCl2	8
最終巻数	770

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アミロペクチン(アミロースフリー)ワックス状トウモロコシ由来	フィッシャーサイエンティフィック	A0456 (英語
アミロース	バイオシンス カーボシンス	YA10257
ATP、二ナトリウム塩	ミリポアシグマ	A3377 (英語
D-グルコース-1,6-ビスホスフェート、カリウム塩	ミリポアシグマ	G6893
D-グルコース-6-リン酸、ナトリウム塩	ミリポアシグマ	G7879
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グレードI、酵母由来	ミリポアシグマ	10127655001
牡蠣由来グリコーゲン、II型	ミリポアシグマ	G8751
ヘキソキナーゼ	ミリポアシグマ	11426362001
メタクリル酸キュベット、1.5 mL	フィッシャーサイエンティフィック	14-955-128	メタクリレートは、一部の手順が340nm以下で行われるため、必要です
β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩	ミリポアシグマ	N0505
β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型二ナトリウム塩	ミリポアシグマ	43420
ヌクレオシド5'-二リン酸キナーゼ	ミリポアシグマ	N0379
ホスホエノールピルビン酸、モノカリウム塩	ミリポアシグマ	P7127
ウサギの筋肉由来のホスホグルコムターゼ	ミリポアシグマ	P3397
ウサギの筋肉由来のホスホリラーゼA	ミリポアシグマ	P1261
ウサギの筋肉からのピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ酵素	ミリポアシグマ	P0294
UDP-グルコース、二ナトリウム塩	ミリポアシグマ	U4625

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