細胞プロセスをリアルタイムでモニタリングするための細胞インピーダンスベースの解析

要約

出典: Labadie, T., et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、細胞インピーダンスアッセイを介して、接着細胞の増殖を含む細胞イベントのリアルタイムモニタリングのプロセスを実演します。ここでは、接着細胞が絶縁体として機能し、電極間の電流の流れを制限し、インピーダンスを増加させます。

プロトコル

>注:すべての実験中は、プレートを常にパッケージの紙ラップなどの静電しない表面に置いてください。以下のセクション1に従って、電子マイクロタイタープレート(E-Plateとして設計)に播種する細胞の最適な濃度を決定します。

1. 細胞を感染させるための適切な細胞量の決定

1. 実験の24時間前に、75 cm²フラスコでMDCK(Madin-Darby Canine Kidney)細胞を調製し、新たに分裂した細胞(約80%のコンフルエント)を取得します。
2. 細胞を5mLの1x PBSで洗浄し、3mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を加えて細胞を剥離します。
3. 7 mLの新鮮細胞培養培地を添加し、トリパンブルー染色を施した自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
4. 細胞培養培地で細胞濃度を400,000細胞/mLに調整します。追加のチューブで2倍の段階希釈を行い、200,000の細胞密度を得ます。100,000;50,000;25,000;12,500;および6,250細胞/mL。細胞の種類やその増殖挙動に応じて、細胞の希釈範囲を調整してください。
5. Eプレート(Table of Materials)をRTに数分間放置し、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100 μLの細胞培養培地を加えます。Eプレートの電極には触れないでください。
6. クレードルのロックを解除し、プレートフロントエンドをインピーダンス測定器のクレードルポケットに挿入します(材料表)。インキュベーターのドアを閉めます。
7. ソフトウェアを起動します。
   1. [デフォルトの実験パターン設定] で、選択したクレードルを選択し、トップ ページをダブルクリックして、実験の名前を入力します。「レイアウト」をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。次に、終了したら「適用」をクリックします。「スケジュール」|「ステップ」|「ステップを追加」をクリックします。ソフトウェアは、バックグラウンドインピーダンス(CI)を測定するために1秒のステップを自動的に追加します。
   2. 「Execute」タブの「Start/Continue」をクリックし、「Plot」をクリックし、適切なウェルを選択してすべてのサンプルを追加し、CIが-0.1から0.1の間にあることを確認してから次のステップに進みます。
8. プレートをクレードルから取り外します。
9. ステップ1.4の各細胞懸濁液100 μLを適切なウェルに2回ずつ加え、コントロールとして使用したウェルに100 μLの細胞培地を添加します。EプレートをRTで層流フードに30分間放置して、ウェルの底に細胞が均一に分布できるようにします。
10. Eプレートをクレードルポケットに挿入します。ソフトウェアの「スケジュール」|「ステップの追加」をクリックし、30分ごとに200回の繰り返しでセルを監視するための値を入力します。次に、「開始/続行」を選択します。
11. CIデータを確認してプロットするには、ソフトウェアの「Plot」ボタンをクリックします。プレートに播種してから24時間後の固定期の直前の細胞の濃度を選択して、ウイルス感染中にまだ成長期にある細胞を取得します。CIが最大になると固定相に達します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Eプレート16(6プレート)	ACEAバイオサイエンス株式会社	5469830001	Eプレートはさまざまなパッケージで利用できます
PBSの1X	ライフテクノロジー(gibco)	14040091
TPCK-トリプシン	ワージントン	LS003740
xCELLigence リアルタイム細胞解析装置 S16	ACEAバイオサイエンス株式会社	380601310	xCELLigence RTCA S16 装置には、さまざまな形式 (16 ウェル、96 ウェル、シングルプレート、マルチプレート) があります
75 cm2 組織培養フラスコ	隼	430641ユー
MEM 1X	ライフテクノロジー(gibco)	31095029