インフルエンザウイルスの感染の多様性を測定するためのインピーダンスベースの細胞アッセイ

要約

出典: Labadie, T., et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、CIT₅₀とウイルス感染の多様性との相関関係について説明します。ウイルスに感染した細胞は細胞変性作用を示し、死滅して金微小電極から剥離し、その結果、インピーダンスが低下します。

プロトコル

1. CIT₅₀の値と感染の多重度との相関

1. Eプレートの各ウェルに100 μLの滅菌1x MEM培地を加えます。Eプレートを35°Cで機器のクレードルポケットに挿入します。
2. 説明に従って背景を測定します。
3. ソフトウェアを起動します。
   1. [デフォルトの実験パターン設定] で、選択したクレードルを選択し、トップ ページをダブルクリックして、実験の名前を入力します。「レイアウト」をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。次に、終了したら「適用」をクリックします。「スケジュール」|「ステップ」|「ステップを追加」をクリックします。 ソフトウェアは、バックグラウンドインピーダンス(CI)を測定するために1秒のステップを自動的に追加します。
   2. 「Execute」タブの「Start/Continue」をクリックし、「Plot」をクリックし、適切なウェルを選択してすべてのサンプルを追加し、CIが-0.1から0.1の間にあることを確認してから次のステップに進みます。
4. Eプレートをクレードルから取り外します。
5. 電子マイクロタイタープレートの各ウェルに新たに分割したMDCK細胞の3 x 10⁴を播種し、5%_CO2で35°Cで24時間増殖させ、IAV感染中に複製段階にあるようにします。
6. H1N1ウイルスの既知の6log₁₀TCID₅₀/mL力価を異なる10倍希釈液でMDCK細胞に感染させ、以下の手順に従って再現性を高めるためのリバースピペッティングを使用します。
   1. MDCK細胞を100 μLのMEMで2回すすぎ、FCS(ウイルス増殖培地)は使用しないでください。接種物のさらなる希釈を避けるために、2回目の洗浄後にすべての媒体を取り除くことに注意してください。.
   2. シングルチャンネルピペットを使用して、各ウェルに100 μLのウイルス懸濁液を加えます。コンタミネーションを避けるために、プレートを左から右に始めて、次にプレートの上から下に進め、残りのウェルを蓋で覆います。
   3. プレートを35°Cの機器のクレードルポケットに挿入し、汚染につながる可能性のある突然の動きを避けるために優しくしてください。
   説明されている
   4. ように、少なくとも 100 時間、15 分ごとにセル インピーダンスの監視を開始します。
      1. Eプレートをクレードルポケットに挿入します。ソフトウェアの「スケジュール」|「ステップの追加」をクリックし、30分ごとに200回の繰り返しでセルを監視するための値を入力します。次に、「開始/続行」を選択します。
   5. 2サイクルの測定後(つまり、30分)、「実行」タブの「一時停止」をクリックして装置を一時停止し、Eプレートをクレードルから取り外します。
   6. 1μg/mLのTPCK-トリプシンをウイルス増殖培地に添加し、ウイルスのヘマグルチニンを切断します。
   7. TPCK-トリプシンを含むウイルス増殖培地100 μLを各ウェルに加え、Eプレートをクレードルポケットに挿入します。
   8. 「実行」タブの「開始/続行」をクリックします。
      手記： ウイルス懸濁液をウイルス増殖培地に置き換えることにより、模擬感染細胞に対応するネガティブコントロールを作成することを忘れないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Eプレート16(6プレート)	ACEAバイオサイエンス株式会社	5469830001	Eプレートはさまざまなパッケージで利用できます
MEM 1X	ライフテクノロジー(gibco)	31095029
TPCK-トリプシン	ワージントン	LS003740
xCELLigence リアルタイム細胞解析装置 S16	ACEAバイオサイエンス株式会社	380601310	xCELLigence RTCA S16 装置には、さまざまな形式 (16 ウェル、96 ウェル、シングルプレート、マルチプレート) があります