ウイルスの生存を評価するための細胞インピーダンスベースの生存速度論アッセイ

要約

出典: Labadie, T. et al., Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、細胞変性効果を誘発するウイルスの生存動態を研究するための細胞インピーダンスベースの手法について説明しています。この方法は、生理食塩水で前処理されたウイルス感染付着細胞の電気インピーダンスを測定します。

プロトコル

1. 試薬と出発物質の調製

1. MDCK細胞および無菌細胞培養培地の調製
   1. 10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質(100ユニット/ mLペニシリン、100mg / mLストレプトマイシン)を添加した改変イーグル培地(MEM)でMadin-Darby Canine Kidney (MDCK)細胞を培養します。
   2. 解凍後、MDCK細胞を感染させる前に少なくとも2回継代して、完全に回復させます(ただし、細胞表現型のドリフトを避けるために30継代未満)。
   3. 30 mLの滅菌1x MEMと7.5 x^{10 6} MDCK細胞を含む75 cm²組織培養フラスコを播種し、加湿した5% CO₂インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
2. インピーダンス監視装置の準備
   1. 装置をインキュベーターに35°Cで置き、少なくとも2時間ウォームアップします。
   2. インキュベーターの外側に配置されたコントロールユニットに接続します。
   3. 残りの実験を開始する前に、メーカーが推奨する洗浄手順に進んでください。
3. MDCKセル上でのIAVストックの作製
   1. H1N1ウイルスを増殖および増幅するには、2つの75 cm²組織培養フラスコに7.5 x 10⁶ MDCK細胞を播種し、37°Cで24時間インキュベートして90%〜100%のコンフルエンスに到達させます。
   2. 細胞単層から細胞培養培地を75 cm²フラスコでデカントします。細胞を滅菌した1x PBS5 mLで洗浄します。
   3. PBSを取り外し、1x PBSを5 mL加えて細胞を再度洗浄します。
   4. 1つのフラスコをコントロールとして標識し、PBSを除去してから、15 mLのウイルス増殖培地(1x MEM、0% FCS)を単層に慎重に加えます。このフラスコを、5% CO₂ で 35 °C に維持したインキュベーターでインキュベートします。3日間の増殖後の比較に使用してください。
   5. IAVストックのバイアル1本をRTで解凍し、ウイルス増殖培地(1x MEM、0% FCS)を含む1.5 mLチューブでウイルスを適切な濃度に希釈します。
   6. 75 cm²フラスコから1x PBSを取り出し、細胞単層に希釈したウイルス1 mLを添加することにより、細胞(pfu/細胞)あたり1 x ^10-3または1 x ^10-4プラーク形成単位の多重感染(MOI)でMDCK細胞に感染させます。
   7. 15分ごとにフラスコを定期的に攪拌することにより、RTで45分間MDCK細胞にウイルスを吸着します。
   8. 接種物を静かに取り出し、1μg/mLのTPCK-トリプシン(トリプシン/L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)を含むフラスコ15mLのウイルス増殖培地を加えて、ウイルスのヘマグルチニンHA0をHA1およびHA2サブユニットに切断します(エンドソーム膜とのHA融合およびウイルスゲノムの放出に必要なイベント)。
   9. フラスコを35°Cおよび5%_CO2で少なくとも3日間インキュベートして、ウイルスを複製します。
   10. MDCK細胞を40倍の倍率で顕微鏡で観察し、細胞に対する細胞変性効果(CPE)を探します(細胞コントロールフラスコと比較することにより)。CPEが完全でない場合(つまり、細胞の約80%が基質から分離している場合)、フラスコをインキュベーターにさらに24時間戻します。
   11. CPEが完了したら、細胞培養上清をデカントし、300 x gで10分間遠心分離して、細胞破片をペレット化します。
   12. 清澄化した上清を15 mLチューブに移し、子孫ウイルスを単回使用の滅菌極低温バイアルに分注します。すぐにクライオチューブを-80°Cに置き、ウイルスを凍結してストックします。
4. H1N1ウイルスの既知の6 log₁₀ TCID₅₀/mL力価を異なる10倍希釈液でMDCK細胞に感染させ、以下の手順に従って再現性を高めるリバースピペッティングを使用します。
   1. MDCK細胞を100 μLのMEMで2回すすぎ、FCS(ウイルス増殖培地)は使用しないでください。接種物のさらなる希釈を避けるために、2回目の洗浄後にすべての媒体を取り除くことに注意してください。.
   2. シングルチャンネルピペットを使用して、各ウェルに100 μLのウイルス懸濁液を加えます。コンタミネーションを避けるために、プレートを左から右、次に上から下に開始し、残りのウェルを蓋で覆いながら進めます。
   3. プレートを35°Cで機器のクレードルポケットに挿入し、汚染につながる可能性のある突然の動きを避けるために穏やかにしてください。
   4. ステップ2.10で説明されているように、少なくとも100時間の間、15分ごとにセルインピーダンスのモニタリングを開始します。
   5. 2サイクルの測定後(つまり、30分)、「実行」タブの「一時停止」をクリックして装置を一時停止し、Eプレートをクレードルから取り外します。
   6. 1 μg/mL TPCK-トリプシンをウイルス増殖培地に添加して、ウイルスヘマグルチニンを切断します。
   7. TPCK-トリプシンを含むウイルス増殖培地100 μLを各ウェルに加え、Eプレートをクレードルポケットに挿入します。8. 「Execute」タブの「Start/Continue」をクリックします。
      手記： ウイルス懸濁液をウイルス増殖培地に置き換えることにより、模擬感染細胞に対応するネガティブコントロールを作成することを忘れないでください。

2. IAV生存動力学

1. IAVを35°Cの生理食塩水蒸留水にさらし、細胞インピーダンスの減少を測定することにより、経時的な感染性をテストします。
   1. 蒸留水中の最終濃度35 g / LにNaClを添加することにより、生理食塩水蒸留水を調製します。900 μLの生理食塩水を2 mLのクライオチューブに加えます。
   2. 生理食塩水に100 μLのウイルスストックを加え、クライオチューブをインキュベーター(35°C、5%CO₂)に1時間、24時間、または48時間置きます。
   3. 100 μL (3 x 10⁴ を含む) の新たに分割した MDCK 細胞を 16 ウェルマイクロタイタープレート上に播種し、37 °C および 5% CO₂ で 24 時間増殖します。
   4. 100 μLの曝露されたウイルス(以前に培養培地で10倍に希釈)を逆ピペッティング法を使用して細胞に感染させ、セクション1.4を繰り返すことで再現性を高めます。
2. セルインピーダンスを15分ごとに少なくとも100時間監視します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25%トリプシン	サーモフィッシャー	25200056
75 cm2 組織培養フラスコ	隼	430641ユー
Eプレート16(6プレート)	ACEAバイオサイエンス株式会社	5469830001	Eプレートはさまざまなパッケージで利用できます
FCSの	ライフテクノロジー(gibco)	10270-106
MEM 1X	ライフテクノロジー(gibco)	31095029
PBSの1X	ライフテクノロジー(gibco)	14040091
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー(gibco)	11548876
TPCK-トリプシン	ワージントン	LS003740
xCELLigence リアルタイム細胞解析装置 S16	ACEAバイオサイエンス株式会社	380601310	xCELLigence RTCA S16 装置には、さまざまな形式 (16 ウェル、96 ウェル、シングルプレート、マルチプレート) があります