出典: Borges, C. R. et al., Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (2020年)
このビデオは、生体サンプルの酸化ストレスを評価するためのチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)アッセイを示しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
ヒト血清中の酸化ストレスを評価するためのチオバルビツール酸反応性物質アッセイ
2K 回視聴
⸱
2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
人間の参加者が関与するすべての手続きは、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査
されています1. TBARSアッセイ
>注:TBARSアッセイが開始されたら、停止せずに終了する必要があります。
- 1500 x gで遠心分離したサンプルと標準試料をできるだけ多く取り、4°Cで10分間保存します。遠心分離後は、サンプルとスタンダードの入ったガラス管を、分析するサンプル数だけ必要に応じてRT.ガラス管に保管し、サンプル名をラベル付けしてください。次に、調製した各サンプル(HepG2細胞溶解物、低密度リポタンパク質、ヒト血清)を各ガラス管に100 μL加えます。
- 各サンプルとスタンダードに200 μLの8.1% SDSを加え、ガラス管を円を描くように静かに撫でてサンプルを混合します。
- 3.5 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH = 4)1.5 mLを各サンプルおよび標準試料に加えます。
- 3.5 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH = 4)1.5 mLを各サンプルおよび標準試料に加えます。
- 各サンプルと標準液の最終容量を 4 mL にするには、700 μL の DI 水を加えます。
- 各ガラス管にしっかりと蓋をし、95°Cに設定された加熱ブロックで1時間インキュベートします。
- 加熱ブロックからガラス管を取り外し、氷上で30分間インキュベートします。
- サンプルと標準試料を1500 x gで4°Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、サンプルと標準物質を含むガラス管をRT.
に保ちます 手記：サンプルを氷上または4°Cに保つと、サンプル全体または標準物質が沈殿します。 - 遠心分離の直後に、各チューブから150 μLの上清を分注し、96ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
- ピペットチップを使用して各ウェルから気泡を取り除きます.
手記：気泡の存在により、吸光度の読み取り値に一貫性がなくなり、アッセイの精度が高くなります。 - 532nmで吸光度を読み取ります。ブランクサンプルの平均吸光度読み取り値を、他のすべての吸光度読み取り値から差し引きます。
- 532 nm でのブランク減算吸光度の読み取り値を各標準の既知の濃度に対してプロットして、標準曲線を作成します。線形回帰を使用してデータ点を適合します。標準曲線から得られた線形回帰直線の式を使用して、未知のサンプル濃度を計算します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 x 滅菌 PBS pH 7.4 1 L | VWR、ペンシルバニア州 | 101642--262 | 細胞溶解試薬 |
| 50 mL自立型遠心チューブ | ニューヨーク州コーニング | CLS430897 | 一般資料 |
| 96ウェルプレート、未処理、透明、蓋付き、非滅菌 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ | 280895 | 吸光度を測定するには |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD遠心スピンフィルター装置 | フィッシャーサイエンティフィック、ニューハンプシャー州 | UFC510024 | LDL精製 |
| キャップ、ガラス管用 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ | 14-930-15D | TBARSアッセイ用 |
| 塩化銅II号 | ミズーリ州シグマ | 222011-250グラム | 酸化を誘発する |
| 培養チューブ、使い捨て、スクリューキャップ仕上げ、ホウケイ酸ガラス(13 x 100 mm) | VWR、ペンシルバニア州 | 53283から800 | TBARSアッセイ用 |
| イーグルズ・ミニマム・エッセンシャル・メディウム(EMEM) | ATCC、バージニア | HB-8065 | HepG2細胞培地 |
| Eppendorf Safe-Lock チューブ、1.5 mL | エッペンドルフ、ニューヨーク | 22363204 | 一般資料 |
| Eppendorf Safe-Lock チューブ、2.0 mL | カリフォルニア州ジェネシー・セイティフィック | 22363352 | 一般資料 |
| ウシ胎児血清米国ソース | オメガサイエンティフィック、カリフォルニア州 | FB-11 | 細胞培養用 |
| 氷酢酸 | ミズーリ州シグマ | 27225-1L-R | TBARS試薬 |
| HALTプロテアーゼ阻害剤カクテル(100x) | Thermo Scientific、マサチューセッツ州 | 87786 | 細胞溶解試薬 |
| ヘープス | ミズーリ州シグマ | H3375-250G(英語版) | LDL溶剤 |
| 塩酸(HCl) | フィッシャーサイエンティフィック、ニューハンプシャー州 | A144-212 | 細胞溶解試薬 |
| Legend Micro 17 遠心分離機 | Thermo Scientific、マサチューセッツ州 | 75002431 | 一般資料 |
| 低密度リポタンパク質、ヒト血漿 | ジョージア州アセンズ・リサーチ・アンド・テクノロジー | 12-16-120412 | 生体マトリックスプロトタイプ |
| マグネティック・スター・バー、オクタゴン6-アソートメント | VWR、ペンシルバニア州 | 58948から025 | 一般資料 |
| マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール) | ミズーリ州シグマ | 8207560250 | TBARSスタンダード |
| Multiskan Go マイクロプレート分光光度計 | フィッシャーサイエンティフィック、ニューハンプシャー州 | 51119200 | 吸光度を測定するには |
| NP-40 | EMDミリポアコーポレーション、マサチューセッツ | 492016-100ミリリットル | 細胞溶解試薬 |
| 塩化ナトリウム | ミズーリ州シグマ | S7653-1KGシリーズ | 細胞溶解試薬 |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | ミズーリ州シグマ | 436143から100G | TBARS試薬 |
| 水酸化ナトリウム | ミズーリ州シグマ | 367176から2.5キロ | TBARS試薬 |
| SpeedVacコンセントレータ | Thermo Scientific、マサチューセッツ州 | SC250EXP | 細胞ライセートの濃縮に |
| チオバルビツール酸 | ミズーリ州シグマ | T5500-100G | TBARS試薬 |
| TRISベース | ジョージア州フルカ | 93362 | 細胞溶解試薬 |
タグ
