眼の微小血管増殖をex vivoで研究するための脈絡膜萌芽アッセイ

要約

出典:冨田、Y.、他 眼の微小血管血管新生のex vivo choroid sploading assay. J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオは、眼の微小血管血管新生を研究するための脈絡膜発芽のex vivoモデルの開発を示しています。このアッセイでは、強膜および網膜色素上皮に付着した脈絡膜組織を含むマウスの眼外植片を、脈絡膜微小血管の発芽を促進する特定の条件下で培養します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 準備

1. 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(10000 U / mL)と5 mLおよび10 mLの市販サプリメントを500 mLの血清入り完全クラシック培地に加えます。.最初に培地50mLを分注します.
   手記：汚染を避けるために、媒体をストックに戻さないでください。
2. 完全なクラシックメディウムのアリコートを氷の上に置きます。
3. 70%エタノールを使用して、解剖顕微鏡、鉗子、はさみを清掃します。
4. 細胞培養皿(10 cm)を2つ準備し、1つは解剖顕微鏡で、もう1つは氷上に置きます。各皿に10 mLの完全クラシック培地を入れます。

2. 実験手順(図1)

1. 75-100 mg/kg ケタミンと 7.5-10 mg/kg キシラジンを腹腔内注射して、出生後 (P) 20 付近の C57BL/6J マウスを犠牲にします。解剖する前に、氷上の完全なクラシックメディウムに目を保ってください。
2. 結合組織(筋肉と脂肪組織)と目の視神経を取り除きます。
3. マイクロハサミを使用して、角膜辺縁部の後方0.5mmを円周方向に切断します。角膜/虹彩複合体、硝子体、および水晶体を取り外します。
4. 切断端に対して視神経に向かって垂直に1mmの切開を行い、1mm幅の円周方向のバンドを切断します。複合体の中央領域と周辺領域を分離します。鉗子を使用して、RPE /脈絡膜/強膜複合体から網膜を剥がします。
5. 末梢の脈絡膜バンドを氷上の完全なクラシックメディウムに保持し、もう一方の目を分離し、このプロセスを繰り返して2番目のバンドを切断します。
6. 円形の帯を6~等しい正方形の小片(~1 mm x 1 mm)に切ります。
   手記：エッジには絶対に触れないでください。
7. 製造元の指示に従って、基底膜抽出物(BME)を解凍します。30 μL/ウェルのBMEを24ウェル組織培養プレートの各ウェルの中央に添加します。BMEの液滴が端に触れずにプレートの底部に凸状のドームを形成することを確認してください.
   手記：BMEを冷蔵庫で一晩解凍します。BMEは解凍後いつでも氷上にある必要があります。
8. 組織をBME.
   の中央に置きます 手記：脈絡膜外植片を平らにしないでください。一般的に、組織をBME内で拡張させます。組織の向き(強膜側が上または下)は、実験結果に影響を与えません。
9. プレートを37°Cで10分間インキュベートし、ゲルを固化させます。
10. 500 μLのコンプリートクラシック培地/ウェルを添加します。
11. クラシックメディウムを1日おきに交換します(500μL)。コロイドの発芽は3日後に顕微鏡で観察できます.
    手記：成長因子治療のためには、組織を4時間飢餓状態にします。試験化合物を成長因子を減少させた培地で希釈します(1:50ではなく1:200のブースト)。

3. SWIFT-Choroidコンピュータ定量化法(図2)

>注:成長する血管が覆う面積を測定するためのコンピュータ化された方法が使用されました。定量化の前に、ImageJソフトウェアへのマクロプラグインが必要です。

1. ImageJで脈絡膜の発芽画像を開き、「Image |タイプ|8ビット」とグレースケール。
2. 「画像 |調整 |明るさ/コントラスト(Ctrl / shift / C)」を使用してコントラストを最適化します。
3. 魔法の杖機能を使用して、芽の中心に存在する脈絡膜組織の輪郭を描き、画像から削除します(ショートカットキー「F1」を使用)(図2A、B).
   手記：魔法の杖の許容率を20〜30%に設定します。
4. 無料の選択ツールを使用して画像の背景を削除します(図2C)。「画像 |調整 |しきい値 (Ctrl/Shift/T)」。閾値機能を使用して、背景と周辺に対して微小血管の芽を定義します(図2D)。
5. 「F2」をクリックすると、概要が表示されます。「保存」をクリックして、選択した領域の画像を保存します。後で参照できるように、元の画像と同じフォルダに保存します。
6. サンプルのグループを測定した後、データ解析のために記録したものをコピーします.
   手記：「Analyze |スケールバー付きの画像を使用して「スケールを設定」。

結果

図1:脈絡膜発芽アッセイを示す概略図。
最初に眼球を摘出し、辺縁部の後方約0.5mmで円周方向に切開しました。角膜、虹彩、水晶体、硝子体を切除しました。次に、アイカップの端から視神経に向かって1mmの切り込みを入れました。次に、バンドを切断端の約1.0mm後方に円周方向に切断し、バンドと複合体の周辺領域を分離しました。バンドを約1mm×1mmのピースにカットし、BMEに埋め込んでいます。次に、顕微鏡を使用して、脈絡膜からの微小血管芽を視覚化しました。

図2:SWIFT-Choroidのコンピュータ定量化法。

(A、B)マジックワンド機能を使って、芽の中央...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AnaSed(キシラジン)	アコーン	59339-110から20
基底膜抽出物(BME)マトリゲル	BDバイオサイエンス	354230
細胞培養皿	巣	704001	10cm
セラムとCultureBoostを備えた完全なクラシックメディウム	細胞システム	4Z0-500
エチルアルコール200プルーフ	Pharmco(ファーマコ)	111000200	70%に使用
キムワイプ	キンバリー・クラーク	06-666
顕微鏡	ツァイス	アクシオオブザーバーZ1
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140	10000 U/mL
組織培養プレート(24ウェル)	オリンポス	25〜107
VetaKet CIII(ケタミン)	アコーン	59399-114-10