植物性エストロゲン活性をスクリーニングするためのエストロゲン受容体-レポーター活性アッセイ

要約

出典:Fender, E. et al., Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、植物由来化合物のエストロゲン活性を決定するための細胞ベースのレポーターアッセイについて説明しています。エストロゲン様活性を持つ化合物は、エストロゲン受容体への結合を模倣し、下流のレポーター酵素遺伝子転写を促進します。レポーター酵素は反応で生物発光を生成し、化合物のエストロゲン活性を示します。

プロトコル

1. ヒトエストロゲン受容体βトランスフェクションアッセイ

>注:アッセイプロトコルの1日目には、無菌技術と層流フードが必要です。

1. 標準曲線用の17β-エストラジオールの希釈液を調製します。
   1. 細胞回収培地と化合物スクリーニング培地(CSM)を冷凍庫から移し、37°Cの水浴で解凍します。
   2. 微量遠心チューブの中間体1および2(INT1、INT2)および1-8にラベルを付けます。
   3. INT1に995μLのCSMを、INT2に615μLのCSMを、チューブ1に900μLのCSMを、チューブ2〜8に600μLのCSMを充填します。チューブ8を脇に置きます。
   4. 100 μM 17β-エストラジオールストック5 μLをINT1に移します。チップを捨てます。渦動。
   5. 毎回移す前に、ピペットを3回すすぎ、INT1からINT2に10μLを移します。チップを捨てます。
   6. ピペットを3回すすぎ、INT2から100μLをチューブ1に移します。チップを捨てます。チューブ1からチューブ2に300μLを移します。チューブ3から7についても繰り返します。チューブ7から300μLを廃棄物容器に捨てます。チューブ8はゼロで、エストラジオールは受け取りません。めっき標準液の最終濃度は、400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487、および0 pMエストラジオールです。
2. サンプル化合物を調製します。
   1. ボルテックスサンプル。
   2. 各植物サンプルを 4 μL の DMSO に取り、496 μL の CSM を加えて 0.8% DMSO 溶液を得ます。
3. レポーター細胞を急速に解凍します。
   1. Cell Recovery Mediumのチューブを37°Cのウォーターバスから取り出します。70%エタノールを使用して外面を消毒します。
   2. -80°Cで保存したレポーター細胞を取り出し、予熱したCRM10 mLを凍結細胞のチューブに移して解凍します。
   3. レポーターセルのチューブを閉じ、37°Cのウォーターバスに5〜10分間移します。
   4. レポーター細胞懸濁液のチューブをウォーターバスから取り出します。細胞のチューブを数回穏やかに反転させて、細胞の凝集体を分解し、均質な懸濁液を生成します。チューブの表面を70%エタノールで清掃します。
4. アッセイめっき。
   1. 100 μLのレポーター細胞懸濁液をマルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに分注します。
   2. 100 μLのサンプルをトリプリケートで適切なアッセイウェルに分注します。
   3. プレートを37°Cの加湿5%CO₂インキュベーターに22〜24時間移します。
5. 検出基質と検出バッファーを暗い冷蔵庫で一晩解凍し、2日目に備えます。
6. プレートインキュベーションが終了する直前に、Detection SubstrateとDetection Bufferを冷蔵庫から取り出し、室温と平衡化するまで暗い場所に置きます。RTに着いたら、各チューブを数回静かに反転させて、溶液を完全に混合します。
   1. インキュベーションが完了する直前に、Detection Bufferの内容物全体をDetection Substrateのチューブに注ぎ、ルシフェラーゼ検出試薬を作製します。泡が出ないようにやさしく混ぜます。
   2. インキュベーションが完了したら、プレートを反転させて内容物を適切な廃液容器に捨てます。清潔な吸収性ペーパータオルでプレートをそっと軽くたたいて、ウェルから最後の液滴を取り除きます。
   3. 各ウェルに100 μLのルシフェラーゼ検出試薬を添加します。アッセイプレートを室温で15分間休ませます。プレートを振らないでください。
7. 96ウェルプレート読み取りルミノメーターを使用して発光を定量化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1000 μL ピペット
20 μL ピペット
200 μL ピペット
37°Cウォーターバス
37°C、加湿5%CO2インキュベーター
70%エタノール
分析天びん
細胞培養定格の層流フード
ジメチルスルホキシド
使い捨て培地洗面器、滅菌
ドリップろ過システム
三角フラスコ			125 mLおよび250 mL
HPLCグレードのメタノール
Human ERβ Reporter Assay System、1 x 96 ウェルフォーマットアッセイ	インディゴバイオサイエンス	IB00411	アッセイキット - 24サンプルと標準曲線を分析
凍結乾燥機
マルチチャンネルピペット
オービタルシェーカー
プレート読み取りルミノメーター			例)バイオテックシナジーHTX
ロータリーエバポレーター
丸底フラスコ			50 mL と 300 mL
滅菌マイクロ遠心チューブまたは滅菌マルチチャンネル培地ベイスン
滅菌チップ			200 μL および 1000 μL
Whatmanグレード1ペーパー
ワールパックバッグ			滅菌ポリエチレン袋