1. 細胞培養
- 加湿した37°C/5%CO2インキュベーターで細胞を維持し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM(HeLaおよびA431細胞)または15%FBS(U266B1細胞)を添加したRPMIで培養します。細胞を70〜80%のコンフルエンスに達するまで培養し、その後、トリプシン化して継代するか、アッセイに使用します
手記：培地にはフェノールレッドが含まれていました。アッセイを実施する前に、どの細胞株に対しても血清飢餓は行われませんでした。
2. 接着細胞を用いた2プレートアッセイプロトコールを用いた刺激剤または阻害剤滴定
>注:この手順では、試験化合物の希釈系列から濃度-反応曲線を生成することにより、刺激剤または阻害剤の効力を決定する方法について説明します。
- 細胞播種
- 事前に最適化された密度(STAT3およびSTAT6の両方で40,000 HeLa細胞/ウェル、STAT5で75,000 A431細胞/ウェル)で50 μLの細胞を、適切な培地中の96ウェル組織培養処理プレートに分注します。37 °C/5% CO2.
で一晩インキュベートします。
手記：最適な細胞密度と培養インキュベーション時間を決定する必要があります。
- 試験化合物の希釈
- ポリプロピレン製96ウェルプレートの12ウェルで化合物を連続希釈(半対数間隔希釈)することにより、中間の2倍希釈シリーズの試験化合物を無血清培地に調製します。
手記：EC50 または IC50 の正確な推定のために、少なくとも 2 つの 2 ポイント、半対数間隔の濃度-応答曲線を少なくとも 2 回実行することをお勧めします。
- あるいは、疎水性のジメチルスルホキシド(DMSO)可溶性試験化合物の場合、100%DMSOで初期希釈を行い、次に化合物希釈シリーズを無血清培地に希釈します
手記：DMSOに対するアッセイ耐性は、DMSOビヒクルで試験化合物の滴定を行う前に確立する必要があります。処理した細胞と処理していない細胞の間で溶媒濃度を等しく保つことが重要です。さらに、化合物の段階希釈試験では、溶媒濃度は希釈シリーズ全体で常に一定に保つ必要があります。
- 細胞治療
- 細胞刺激には、無血清培地のみ(未処理の細胞)または刺激装置を含む(2x)50 μLを添加します。
- 室温(RT)または37°C(インターフェロン(IFN)α2b/20分、室温(STAT3)、上皮成長因子(EGF)/室温10分(STAT5)、インターロイキン(IL)-4/20分、室温(STAT6)のいずれかで、あらかじめ最適化された時間インキュベートします。次に、セクション 2.4.
に進みます。
手記：最適なインキュベーション温度を決定する必要があります。
- 細胞阻害のためには、25 μLの無血清培地のみ(未処理の細胞)または阻害剤を含む(4x)を加えてください。
- 室温または37°Cで事前に最適化された時間インキュベートします(JAK阻害剤を室温で1/30分間、STAT3およびSTAT6;エルロチニブ/STAT5 の RT で 15 分間)。
- 25 μLの無血清培地(未処理細胞)のみ、または刺激装置を含む(4x)EC80で追加します。
- 室温または37°Cで事前に最適化された時間インキュベートします(ステップ2.3.2と同じ条件)。
- 細胞溶解
- キットの特定の1x Supplemented Lysis Bufferをメーカーの指示に従って調製します
手記：1x Lysis Bufferに、最終濃度1xに希釈した100x Phosphatase Inhibitor Cocktailを添加することが必須です。1x Supplemented Lysis Bufferには、1 mMのフッ化ナトリウム、2 mMのオルトバナジン酸ナトリウム、および2 mMのβ-グリセロリン酸が含まれています。他のホスファターゼ阻害剤は必須ではなく、避けるべきです。キットに含まれているもの以外の溶解バッファーおよびホスファターゼ阻害剤は、測定を妨げる可能性のある成分が含まれている可能性があるため、推奨されません。
- 細胞培養培地は、上清を吸引して慎重に取り出して廃棄します。
- 直ちに50 μLの1x Supplemented Lysis Buffer.
を添加してください。
手記：Lysis Bufferの容量(25-50 μL)を最適化できます。
- 振とう下でRTで30分間インキュベートします(眼窩プレートシェーカーを400rpmに設定、中程度の撹拌).
手記：溶解インキュベーション時間(30-60分)を最適化することができます。ライセートは、標的タンパク質の検出にすぐに使用することも、-80°Cで凍結することもできます。
- TR-FRET検出
- 4x Antibody Detection Mixを1x Detection Bufferに調製し、メーカーの指示に従ってください。
- この移し替えステップでは、96ウェル培養プレートから15 μLの細胞ライセートを白色の低容量384ウェルマイクロプレートのウェルに慎重にピペットで移します。
- 15 μLのポジティブコントロールライセートと15 μLの1x Lysis Buffer(ネガティブコントロール)を分注して、アッセイウェルを分離します。
- 4x Antibody Detection Mix(リン酸化タンパク質の検出にはEu-Ab1/FR-Ab2、全タンパク質の検出にはEu-Ab3/FR-Ab4のいずれか)を各アッセイウェルに5 μL加えます。
- プレートをプレートシーラーで覆い、アッセイに応じてRTで1時間から一晩インキュベートします(対応する技術データシートを参照)
手記：最適な読み取り時間は、各アッセイおよび細胞株ごとに最適化する必要があります。プレートは数回読み取ることができ、アッセイ性能に悪影響を与えることはありません。
- 粘着プレートシーラーを取り外し、TR-FRET対応マイクロプレートリーダーでプレートを読み取ります><。
手記：フィルターベースの蛍光光度計をお勧めしますが、一部のモノクロメーター機器も使用できます。TR-FRETに適した光モジュール(フィルターとミラー)が取り付けられていることを確認します。320 nmまたは340 nmの励起波長を使用して、ユーロピウムキレートを励起します。615 nm(または620 nm)と665 nmの両方でアッセイを読み取り、ドナーEuropiumとアクセプター蛍光色素の両方からの発光をそれぞれ検出します。機器の設定は、特定のリーダーによって異なります。ここに示すデータは、ランプベースの励起、90 μsの遅延、300 μsの積分時間、およびウェルあたり100回のフラッシュを使用して取得されました。しかし、リン酸化STAT4アッセイは、レーザー励起を使用して読み取られ、より高いシグナル対バックグラウンド(S/B)比が得られました。
