人間の参加者が関与するすべての手続きは、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査
されています
1. ヒト神経前駆細胞(hNPC)の単離と培養
- 脳組織を100mmのシャーレに入れ、鉗子を使用して髄膜を慎重に取り除きます。
- 脳組織を50mLのコニカルチューブに移し、チューブを静かに反転させて20mLのPBSで2回洗浄します。
新しい- 50 mLコニカルチューブで脳組織を細胞解離溶液(材料表を参照)およびDNase I(10 U/mL)に37°Cで10分間浸漬して、脳組織をインキュベー
トします。
- 5 mLの神経細胞培養培地(材料の表を参照)を脳組織含有チューブに加え、1000 μLのピペットチップで20〜30回トリチュレートしてニューロスフェアを機械的に解離し、シングルセル懸濁液を作製します。
- 70 μmのセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、細胞クラスターを除去します。
- シングルセル懸濁液を通気孔のあるT-25フラスコに、表1に詳述する成分を添加した5〜10 mLのニューロン細胞培養培地を播種します。
- 0.2 μmフィルターによるろ過により、ヘパリン溶液を滅菌します。ビタミンAを含まないB-27サプリメントは、分化を誘導することなく神経前駆細胞や幹細胞を培養するための無血清サプリメントです
手記：ヒト神経前駆細胞(hNPC)は、中絶された胎児から採取されたヒト胎児の脳から単離されます。培養に7〜10日後、神経幹細胞(NSC)は浮遊するニューロスフェアコロニーを形成しますが、他の細胞タイプは単一細胞として懸濁したままであるか、フラスコの底に付着します。単離されたhNPCは、ニューロスフェアとして数ヶ月間懸濁液として培養することができます。
2. hNPCの通過
- 浮遊球、大小のニューロスフェアを含む培地を収集し、それらを50mLの円錐管に移します
手記：理由は不明ですが、ニューロスフェアを分割するタイミングは7日から30日までさまざまです。ただし、一般に、ニューロスフェアは直径が700〜900μmを超えると継代する必要があります。これは、ニューロスフェアの中心が暗くなり始めるときであり、これは細胞死率が高い兆候と考えられています。
- ニューロスフェアを300〜400 x gで3分間遠心分離することにより、ニューロスフェアを回転させます。
- 上清を慎重に吸引し、解凍した細胞解離試薬500μLに球体を沈めます(材料の表を参照)。
- 1.5 mLマイクロチューブあたり500 μLを添加して細胞解離試薬のアリコートを作成し、-20°Cで保存します。酵素活性の損失を防ぐため、細胞解離試薬を室温で保持するか、37°Cの水/ビーズ浴で5分間温めて解凍します。
- 球体の密度とサイズに応じて、水中の球体を37°Cで5〜15分間インキュベートします。
- 50 mLのコニカルチューブを含むニューロスフェアに5〜10 mLの予熱済み培地を加え、300〜400 x gで5分間遠心分離してニューロスフェアを沈殿させます。
- 上清を吸引し、1000 μLのピペットを使用して、すべてのニューロスフェアがシングルセル懸濁液になるまで2 mLの培養培地で静かに上下させます><。
手記： 解離は肉眼で見えるようになります。解離する前は、ニューロスフェアは球体の形であります。解離試薬に浸漬し、ピペッティングで上下させることで、単一細胞になります。
- T-25フラスコあたり200万から300万個の単一細胞を10 mLの培養培地でカウントし、プレート
化します。
- 3日ごとに培養培地の半分を交換して細胞を給餌します。
- フラスコを下の角にくるように傾けて、ニューロスフィアを落ち着かせます。ニューロスフェアが沈殿するまで、フラスコをその位置に約1〜2分間保持します。次に、落ち着いたニューロスフェアの上のメディアに血清学的ピペットを挿入して、メディアの半分を静かに吸引します。解離した細胞は、培養で2〜3日後に凝集して球を形成することができます。
3. hNPCの凍結
- DMSOを最終濃度10%(v/v)まで培養培地に添加して細胞凍結培地を調製するか、感受性細胞タイプ用の市販の凍結保存培地を使用します(材料表を参照)。
- メディアを50mLの円錐形チューブに移し、球体を重力によって沈殿させることにより、大きな球体を選別します。次に、大きなニューロスフェアを取り外して新しい50 mLコニカルチューブに移し、200または1000 μLのピペットチップを使用して継代します><。
手記： 直径が900μmを超えるニューロスフェアは大きいと見なされ、直径が500μm未満のニューロスフェアは小さいと見なされます。
- 残りのニューロスフェアを300〜400 x gで遠心分離して3分間スピンダウンします。
- 1 mLの凍結保存試薬に最大100個の球体を再懸濁し、クライオチューブに移します。
- 細胞凍結容器(材料の表を参照)で-80°Cで一晩保存し、翌日液体窒素に移して長期保存します
手記：小型から中型のニューロスフェア(直径900μm未満)を凍結し、大型のニューロスフェア(直径900μm以上)または単一細胞の凍結を避けることが望ましいです。サンプルの解凍中に細胞の損傷を減らすには、解凍したニューロスフェアを小さなT25フラスコに播種して細胞の密度を保ちます。
4. 神経毒性評価
>注:試験化合物の細胞毒性は、発光細胞生存率アッセイ(材料表を参照)を使用して、384ウェルプレート(材料表を参照)で評価されます。hNPCは、「hNPCの分化と処理」の項で説明したわずかな変更を除いて、同じ方法で調製されます。続いて、発光細胞生存率アッセイによって生成された発光シグナルをマイクロプレートリーダーを用いて測定します。発光シグナルは細胞のATP濃度に比例し、それ自体が各ウェルに存在する生細胞の数に正比例します。
- コーティング
- 384ウェルプレートのウェルあたり30 μLのポリ-L-リジン(PLL)を添加します。
- RTで1時間インキュベートします。
- PBSで2回洗ってください。
- RTで乾かします(約30分間)。
- 384ウェルプレートのウェルあたり30 μLのラミニン(50 μg/mL)を添加します。
- 37°Cで2時間インキュベートします。
- PBS.
で2回洗浄します
手記： コーティングされた384ウェルプレートは、4°Cで1ヶ月間保存できます。
- セルのめっき
- 25 μL の分化培地中の 384 ウェルプレートのウェルあたり 20,000 個のシングルセルニューロスフェアをカウントし、プレート
化します。
- 37°Cで5日間インキュベートします。
- 5日後、5 μLの容量で最終所望濃度の6倍で調製した試験化合物により、細胞を24時間処理します(ウェルあたり最終容量を30 μLにします)。
- 細胞生存率アッセイ
- 384ウェルプレートのウェルあたり30 μLの発光細胞生存率アッセイ試薬を添加します><。
手記：各ウェルに存在する容量に等しい容量の発光細胞生存率アッセイ試薬を添加します。発光細胞生存率アッセイ試薬を解凍し、使用前にRTに平衡化してください。
- プレートシェーカーで2分間振とうします(細胞溶解を混合して誘導するため)。
- 混合物を300〜400 x gで30秒間遠心分離することにより、混合物をスピンダウンします。
- 384ウェルプレートを室温で10分間、光から保護された場所でインキュベートします(発光シグナルを安定させるため)。
- マイクロプレートリーダーで発光を記録.
手記：Velcade(最終濃度10μM)をポジティブコントロール、HBSS含有DMSO(最終濃度0.1%または0.2%)をネガティブコントロールとするなど、生存率アッセイに適したコントロールを使用してください。
>表1. 培地100mLを作るために必要な成分
の
| 量 | コンポーネント |
| 100μL | EGF(20 ng / mL) |
| 100μL | FGF(10 ng / mL) |
| 2ミリリットル | B-27、ビタミンAマイナス(50倍) |
| 1 mL | L-アラニル-L-グルタミン(100X)(材料の表を参照) |
| 4 μL | ヘパリン(2μg/mL) |
| 96.8ミリリットル | 神経細胞培養液(材料表参照) |
