利益相反は宣言されていません。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="常に">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18mmサークルカバースリップ</td>
			<td>サーモサイエンティフィック</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>使用前に滅菌してください</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>サイトカラシンD</td>
			<td>インビトゲン</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>DMSOに溶解</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFreeプラスミドマキシキット</td>
			<td>キアゲン</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛍光封入剤</td>
			<td>ダコ</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td>
			<td>インビトゲン</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>パラホルムアルデヒド</td>
			<td>シグマ・アルドリッチ</td>
			<td>P6148</td>型
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>の
			<td>クロンテック</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>参考文献8および15を参照してください</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSタブレット</td>
			<td>ギブコ</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td>
			<td>ギブコ</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩</td>
			<td>シグマ・アルドリッチ</td>
			<td>P7280</td>型
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スパーテル</td>
			<td>シグマ・アルドリッチ</td>
			<td>S4147</td>シリーズ
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド</td>
			<td>ギブコ</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

神経突起伸長に対する標的タンパク質の影響を評価するための免疫蛍光アッセイ

出典: Chan, W., W., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">An Enhanced Green Fluorescence Protein-Based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019年)。
このビデオでは、EGFPベースの免疫蛍光アッセイを実演し、初代皮質ニューロンの神経突起伸長に対する標的タンパク質の有効性を特定します。初代ニューロンに蛍光タンパク質、EGFP、標的タンパク質をトランスフェクトし、その後、イムノアッセイを行い、標的タンパク質が神経突起伸長に及ぼす影響を調べます。

出典:Chan、W.、W.、R.他初代ニューロンの神経突起伸長を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ。J. Vis. Exp.
...

発達中のニューロンは、神経突起の成長によって細胞体から細胞質プロセスを拡張し、ニューロン間のコミュニケーションに不可欠な樹状突起と軸索を発達させます。
神経突起の伸長に対する標的タンパク質の影響を研究するには、その基部にポリ-D-リジンでコーティングされたカバーガラスを備えたマルチウェルプレートを取ります。カバーガラスの表面には、ラット胚の脳に由来する初代皮質ニューロンの接着培養物があります。
2種類のプラスミド(増強された緑色蛍光タンパク質をコードするEGFPプラスミドと、適切なトランスフェクション試薬中の標的タンパク質をコードする2番目のプラスミド)を含むミックスでニューロンを処理します。
トランスフェクション試薬は、プラスミドの細胞への侵入を促進します。
トランスフェクション後、両方のプラスミドが発現し、緑色の蛍光タンパク質と標的タンパク質が生成されます。EGFPの発現は、共トランスフェクトされた細胞に緑色の蛍光を与えます。
神経突起の伸長を刺激する可能性のある標的タンパク質は、細胞シグナル伝達を開始し、細胞骨格の再編成を促進し、ニューロンの投射とその拡張の発達につながります。
使用済み培地を吸引し、細胞をパラホルムアルデヒドで固定します。発現した標的タンパク質に特異的に結合し、細胞に追加の赤色蛍光を与える赤色蛍光タグ付き抗標的タンパク質抗体を使用して細胞を対比染色します。
培養プレートからカバーガラスを取り外し、蛍光顕微鏡で観察します。
二色蛍光シグナルを示す共トランスフェクト細胞は、赤色蛍光を欠いた細胞よりも長い神経突起を示し、神経突起の伸長に対する標的タンパク質の刺激効果が確認されています。

摂氏37度、二酸化炭素5%で2日後、EGFPと標的タンパク質プラスミドDNAおよびトランスフェクション試薬を2つの別々の1.5ミリリットルチューブで希釈し、それらを混合します。トランスフェクションミックスをウェルに添加することにより、EGFPコンストラクトで細胞をトランスフェクトします。
24時間後、細胞を摂氏37度のPBSで洗浄し、室温の暗所で10分間PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定します。
インキュベーションの最後に、洗浄ごとに固定細胞を新鮮なPBSで3回洗浄し、サンプルごとに1枚の顕微鏡スライドガラスに最小量の蛍光封入剤を加えます。次に、コーティングされたカバーガラスを、サンプルをスライドガラスに向けるように、慎重に封入剤に移します。
神経突起の成長を画像化するには、落射蛍光顕微鏡で40倍の対物レンズを選択し、「開始」をクリックして、トランスフェクションごとに少なくとも40個の無傷のEGFP陽性ニューロンから画像をキャプチャします。
新しい権利がすべて画像化されたら、NeuronJプラグインでキャプチャした画像をImageJで開き、細胞体から成長円錐の先端までの各ニューロンの最長神経突起の長さを測定します。次に、ソフトウェアで得られたデータを分析して、神経突起の成長に対する標的タンパク質の影響を判断します。

immunofluorescence-assay-to-evaluate-effect-target-proteins-on

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

生物学的技法

Assay Techniques

分析手法

Immunoassays

免疫測定法

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 ビュー. 発達中のニューロンは、神経突起の成長によって細胞体から細胞質プロセスを拡張し、ニューロン間のコミュニケーションに不可欠な樹状突起と軸索を発達させます。 神経突起の伸長に対する標的タンパク質の影響を研究するには、その基部にポリ-D-リジンでコーティングされたカバーガラスを備えたマルチウェルプレートを取ります。カバーガラスの表面には、...

神経突起伸長に対する標的タンパク質の影響を評価するための免疫蛍光アッセイ

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名前	会社	カタログ番号	コメント
18mmサークルカバースリップ	サーモサイエンティフィック	CB00180RA	使用前に滅菌してください
サイトカラシンD	インビトゲン	PHZ1063	DMSOに溶解
EndoFreeプラスミドマキシキット	キアゲン	12362
蛍光封入剤	ダコ	S302380
リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬	インビトゲン	11668019
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148
pEGFP-C1	クロンテック	#6084-1
pCI FE65			参考文献8および15を参照してください
PBSタブレット	ギブコ	18912014
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P7280
スパーテル	シグマ・アルドリッチ	S4147
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	ギブコ	25300062