特異的なタンパク質間相互作用を同定するためのスプリットルシフェラーゼ相補アッセイ

Abstract

出典: Wiertelak, W. et.al., Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay. J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、タンパク質間相互作用を検出するための分割ルシフェラーゼ相補アッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質がルシフェラーゼ酵素の小さなフラグメントと大きなフラグメントにタグ付けされます。タンパク質が相互作用すると、大小の断片が結合して活性酵素複合体を形成し、特定の基質の存在下で測定可能な明るい発光を放出します。

Protocol

1. 発現プラスミドの細胞内への一過性トランスフェクション

1. 接着性細胞培養HEK293Tトリプシン処理により回収し、細胞を専用の完全増殖培地に再懸濁します。細胞(2 x 10⁴/100 μL/ウェル)を透明な底面の白い96ウェルプレートにプレートします。ウェルの総数を調整して、反復を含むすべてのテスト済みの組み合わせとコントロールに対応します.
   手記：プレートの内側の60ウェルのみを使用して、熱シフトを最小限に抑え、夜間の蒸発を避けてください。材料表に示されているようなポリD-リジンコーティングされたプレートを使用することを強く推奨します。そうしないと、その後の洗浄ステップで細胞が剥離する可能性があります。
2. 細胞を標準条件(37°C、5%CO₂)で一晩培養します。
3. 翌日、目的の発現プラスミドの組み合わせで細胞をトランスフェクションします。
   1. 無血清培地(材料表を参照)中の発現プラスミドを、各コンストラクトについて6.25 ng/μLに希釈します。
   2. 脂質ベースのトランスフェクション試薬を適切な脂質対DNA比で添加し、製造元の指示に従ってインキュベートします。
   3. 8 μLの脂質:DNA混合物を指定のウェルに加えます。プレートの中身を緩やかに回転させて混ぜます。これにより、両方の発現コンストラクトが50 ng/ウェルでトランスフェクションされます。
4. 細胞を標準条件(37°C、5%CO₂)で20〜24時間培養します
   手記：細胞を長期間培養すると、融合タンパク質の発現レベルが高くなる可能性があり、フラグメント間の非特異的な会合が促進される可能性があります。

2. 中規模交換

1. 翌日、各ウェルで馴染ませた培地を100 μLの無血清培地と交換します。培地交換時に細胞が剥離していないことを確認してください.
   手記： このステップは、フリマジン作業溶液を添加する2〜3時間前に行う必要があります。血清の離脱は、フリマジンの自己発光によって引き起こされるバックグラウンドを最小限に抑えます。.

3. フリマジン作業溶液の調製

1. 測定の直前に、1容量のフリマジンと19容量の希釈バッファー(20倍希釈)を混合します
   手記： 調製するフリマジン作動溶液の総容量は、分析する個々のウェルの数によって異なります(フリマジン作動溶液は細胞培養培地に1:5の比率で添加されるため、以前に100μLの無血清培地で満たされた各ウェルに25μLのフリマジン作動溶液を添加する必要があります)。
2. フリマジン作業溶液を指定のウェル(25 μL/ウェル)に加えます。プレートを手で、またはオービタルシェーカー(例:300〜500rpmで15秒)を使用してプレートを穏やかに混合します。

4. 発光の測定

1. プレートを発光マイクロプレートリーダーに挿入します。
   1. 37°Cで実施する実験の場合は、プレートを指示された温度で10〜15分間平衡化します。
2. 分析するウェルを選択します。
3. 0.3秒の積分時間で発光を読み取り、必要に応じて最大2時間発光をモニターし続けます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%トリプシン-EDTA溶液			細胞培養
接着性哺乳動物細胞株			細胞培養
BioCoat Poly-D-Lysine 96ウェル ホワイト/クリアフラットボトムTC処理マイクロプレート、蓋付き	コーニング	356651	プラスチック製品
細胞培養用遠心分離機			プラスチック製品
細胞培養サプリメント(加熱不活化ウシ胎児血清、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン)			細胞培養
CO2インキュベーター			デバイス
NanoBiTフラグメントでタグ付けされていない目的タンパク質をコードする発現プラスミド			試験
FuGENE HDトランスフェクション試薬	プロメガ	E2311	試験
GloMax Discover マイクロプレートリーダー (または別の発光マイクロプレートリーダー)	プロメガ	GM3000	デバイス
使用する細胞株専用の増殖培地			細胞培養
標準的な分子クローニング用材料・試薬(細菌、耐熱性ポリメラーゼ、制限酵素、DNAリガーゼ、核酸精製用材料・試薬)			試験
NanoBiT MCSスターターシステム	プロメガ	N2014	このキットには、目的のタンパク質をさまざまな配向のNanoBiTフラグメントでタグ付けできるベクターと、SmBiTと融合したHaloTagタンパク質をコードするコントロールプラスミドとポジティブコントロールプラスミドペアが含まれています。
Nano-Glo ライブセルアッセイシステム	プロメガ	N2011	本キットには、生細胞中のNanoLuc活性を検出できる基質であるフリマジンと、専用の希釈バッファーが含まれています。
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red (オプティメム I 還元型血清中、フェノールレッド不	ギブコ	11058021	細胞培養
オービタルシェーカー			デバイス