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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査
されています
1. MeCP2-ECLIAプロトコル
- 洗浄液、ブロッキングバッファー、アッセイ希釈液の調製(1日目)
- 500 μL の Tween 20 を 1 L の PBS 溶液に加え、0.05% Tween 20 in PBS 溶液に調製し、激しく混合して「洗浄液」とラベル付けします
手記：新しく準備された洗浄バッファーのみを使用していることを確認してください。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3%ブロッカーA(材料表)のブロッキング溶液を調製します。穏やかに攪拌して混ぜ、ろ過滅菌し、最大2週間使用するまで冷蔵庫に保管します。
- 10 mLのPBSに5 mLのブロッキング溶液を加えて、アッセイ希釈液(PBS中の1%ブロッカーA)を調製します。
- ハイバインドプレートのコーティング
- 96ウェルマルチアレイシングルスポットハイバインドプレートを取り出します.
手記：高結合プレートは、結合容量が大きいため、疎水性表面を持つ標準プレートよりもダイナミックレンジが広くなります。
- マウスモノクローナル抗MeCP2抗体を氷上で解凍し、0.67 μLの抗体を4 mLのPBS(PBSで1:6,000に希釈)と混合します。抗体溶液をボルテックスしてよく混合し、チューブに「コーティング溶液」とラベルを付けます。
- マルチチャンネルピペッターを使用して、各ウェルの底隅に25 μLのコーティング溶液を慎重に分注します。これを溶液コーティング法と呼びます。96ウェルプレートの両側を軽くたたいて、コーティング溶液が各ウェルの底を覆うようにします。
- プレートを接着ホイルで密封し、プレートを冷蔵庫で4°Cで一晩(12−16時間)インキュベートします。
- ブロッキング(2日目)
- 冷蔵庫からプレートを取り出し、ホイルを取り除きます。
- 抗体コーティング液をゴミ箱にフリックして取り出し、プレートをペーパータオルで軽くたたいてウェルからすべてのコーティング液を取り除きます。
- 1ウェルあたり125 μLのブロッキング溶液を添加します。プレートを再度シールし、オービタルマイクロプレートシェーカーに置きます。
- プレートを室温で90分間インキュベートし、800rpmで一定に振とうします。
- 標準試料およびサンプルの調製
- インキュベーション期間中に、MeCP2および/またはTAT-MeCP2タンパク質スタンダードと各種サンプルを調製します
手記：標準希釈に使用する溶解バッファーは、分析したサンプルに使用したものと同じでなければなりません。
- MePC2および/またはTAT-MeCP2タンパク質ストック溶液(250 μg/mL)、マウス脳溶解物、およびHDF溶解物を1バイアル取り出し、-80°Cから氷上で解凍します。
- 表1に従って、標準原液(MeCP2および/またはTAT-MeCP2)をきれいなチューブで希釈します。
- 溶解バッファーでサンプルを希釈します:溶解バッファー25μLあたり1-20μgのマウス脳溶解液、および溶解バッファー25μLあたり0.25-1μgのHDF溶解液。各サンプルを3回に分けて分析するのに十分な量を準備します。
- サンプルと標準溶液の追加
- ブロッキング溶液を廃棄物バスケットにフリックして取り出し、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて、ウェルからすべてのブロッキング溶液を取り除きます。
- 150 μLの洗浄液を加えてプレートを3回洗浄し、すぐに取り除きます。
- シングルチャンネルピペットを使用して、25 ulの標準試料とサンプルをウェルの下隅に加えます。
- プレートを密封し、プレートを室温で4時間インキュベートし、800rpmで絶えず振とうします。
- 非標識検出抗体
- ポリクローナルウサギ抗MeCP2抗体を氷上で解凍します。抗体をアッセイ希釈液で1:6,000に希釈します。
- スタンダードとサンプルをゴミ箱にフリックして取り出し、プレートをペーパータオルで軽くたたきます。
- 150 μLの洗浄液を加えてプレートを3回洗浄し、すぐに取り除きます。
- 25 μLの非標識検出抗体をマルチチャンネルピペッターで各ウェルに加えます。プレートをシールし、室温で800rpmで絶えず振とうしながら1時間インキュベー
トします。
- 特異的標識抗体
- 特異的二次抗体(Table of Materials)を冷蔵庫から取り出し、氷の上に置きます。抗体をアッセイ希釈液で1:666.67に希釈し、穏やかに混合します。
- 遊離の非標識二次抗体をゴミ箱にフリックして取り出し、プレートをペーパータオルで軽くたたきます。
- 150 μLの洗浄液を加えてプレートを3回洗浄し、すぐに取り除きます。
- 25 μLの特異的標識抗体(Table of Materials)をマルチチャンネルピペッターで各ウェルに加えます。プレートをシールし、室温で800rpmで絶えず振とうしながら1時間インキュベートします。
- プレートの読み取り
- 遊離標識抗体(Table of Materials)をゴミかごに入れて取り出し、ペーパータオルでプレートを軽くたたきます。
- プレートを150μLの洗浄液で3回洗浄します。
- 1x TrisベースのGoldリードバッファー(材料表)150 μLを、トリプロピルアミンを光発生用共反応剤として含有する界面活性剤とともにプレートに加えます。リバースピペッティング技術を使用して気泡を避けてください。
- プレートをマイクロプレート検出プラットフォーム(Table of Materials)に置き、すぐに測定を開始します。96ウェルプレート取得の設定を使用します。
- 電気化学発光検出システム(Table of Materials)に内蔵されたCCDカメラで電気化学発光信号を捕捉し、相対光単位(RLU)に対応し、光の強度に正比例する信号カウントを記録します
手記：電気化学刺激を受けると、炭素電極に結合したルテニウム標識が620nmで発光光を発します。装置付属のソフトウェア(Table of Materials)でデータを解析します。
>表1:0〜1,800 ng / mLの標準シリーズ。
| 標準 | 濃度 | 希釈 |
| スタンダード1 | 1,800 ng/mL | 1.08 μL 標準原液 + 148.92 μL 溶解バッファー |
| スタンダード2 | 600 ng/mL | 50 μL 標準 1 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード3 | 200 ng/mL | 50 μL 標準液 2 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード4 | 66.67 ng/mL | 50 μL 標準液 3 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード5 | 22.22 ng/mL | 50 μL 標準 4 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード6 | 7.41 ng/mL | 50 μL 標準液 5 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード 7 | 2.47 ng/mL | 50 μL 標準 6 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード 8 | 0.82 ng/mL | 50 μL 標準 7 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード 9 | 0.27 ng/mL | 50 μL 標準液 8 + 100 μL 溶解バッファー |
| スタンダード10 | 0 ng/mL | 150 μL 溶解バッファー |