標的遺伝子のインデル変異検出のためのデジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応

要約

出典: Carballar-Lejarazú, R., et al. Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオは、DNAサンプルのインデル変異を特定する際のデジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応の役割を示しています。ddPCRの高精度と感度により、サンプル中に存在するまれな変異を、低レベルでも正確かつ一貫して検出することができます。ゲノムのさまざまな領域におけるインデル変異を同定し、定量化することができ、突然変異のメカニズムとこれらの突然変異の機能的影響について貴重な洞察を得ることができます。

プロトコル

1. ddPCR反応と液滴生成の準備

1. 蛍光光度計を使用してDNAを定量します.
   手記： ドロップオフアッセイでは、1反応あたり3,000〜30,000の一倍体ゲノムコピーの範囲を使用することが推奨されます。これは、標的切断部位のWT配列に結合し、標的部位に欠失または挿入がある場合にアニーリング(ドロップオフ)しないHEX標識プローブでNHEJイベントを検出するように設計されています。 NHEJ変異体の存在を示しています。
2. 一倍体ゲノムの重量と抽出物中のDNAの濃度を使用してコピー数を計算します。これは、抽出されたDNAの濃度に、総DNA質量を得るために使用された体積を掛け、それを一倍体ゲノムの重量で割ることによって行われます。添加する容量が1〜10μLであることを確認してください。推奨される一倍体ゲノムコピー範囲に収まるように必要に応じて希釈してください。
   手記：1つのハマダラカ一倍体ゲノムは、成虫の蚊あたり0.27 pgと推定されています。
3. プライマーとプローブを設計します。gRNAターゲットサイトの5'末端と3'末端に隣接する55〜60°Cの範囲のプライマー融解温度(Tm)で、150〜400 bpのアンプリコンを生成するフォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計します。
   1. NHEJ検出用HEX(ヘキサクロロフルオレセイン)標識プローブ:ターゲット部位に相補的な長さ~15-20 bpのオリゴヌクレオチドを設計し、HEXプローブを5'末端に追加し、BHQ1(BLack Hole Quencher 1)を3'末端に追加します。加水分解プローブのTmは、プライマーのTmよりも3〜10°C高くする必要があります。
   2. 参照WT用のFAM(6-カルボキシフルオレセイン)標識プローブ:ターゲットサイトから離れた(約25 bp)保存されたゲノム部位に相補的な長さのオリゴヌクレオチド~15-20 bpを設計し、FAMプローブを5'末端に、BHQ1を3'末端に追加します。加水分解プローブのTmは、プライマーのTmよりも3〜10°C高くする必要があります。

2. PCR反応の準備

1. プローブ用ddPCRスーパーミックス(UTPなし):12.5 μL、フォワードおよびリバースプライマー(10 μM):各1 μL、HEX/FAMプローブ(10 μM):各0.625 μL、DNA:1-5 μL(3,750-37,500 Haploid Genome Copies)、水:最大25 μL。
2. ボルテックスまたは還流ピペッティング(上下)(20倍)で反応を完全に混合します。.
   手記： 反応が96ウェルプレートにある場合は、気泡の形成を避けるために、ボルテックスではなく、全ボリュームを20回上下にピペット
で動かします。
3. サンプルを短時間遠心分離して、混合物をチューブの底またはウェルに沈殿させます
   手記：液滴生成のために反応が室温にあることを確認してください。各カートリッジの余分な/未使用のウェル用に1xのddPCRミックスを調製します(各カートリッジには8つのウェルがあります)。

3. 液滴の生成

1. 50 μLのマルチチャンネルピペットを使用して、20 μLのddPCRサンプルミックスをカートリッジの中央列にロードします(図1A、上)。
2. 70μLのオイルを一番下の列にロードします。20 μL の 1x ddPCR スーパーミックスを未使用のウェルにロードします.
   手記：気泡は導入しないでください。
3. ガスケットを端だけに接触させて、中央の凹んだ領域を避けて置きます(図1B)。
4. プレートを液滴発生器にしっかりと置き、カバーを閉じて実行を開始します。
5. マルチチャンネルピペットを使用して、カートリッジの最上段(図1A、下)から40 μLのエマージョンミックスを96ウェルプレートに移します。
   1. 液体サンプルを45〜30°の角度で3〜5秒間引き込みます。混合物を45°の角度で3秒以上ゆっくりとウェルの側面に排出し、側面に滴下させます。ピペットの2回目の停止(完全排出)に行って、すべての液体を排出しても大丈夫です。
6. ホイルヒートシールを使用して、プレートを180°Cで5秒間シールします。

4. PCR

1. 密封されたプレートをサーモサイクラー(図1C)にセットし、NHEJドロップオフガイドラインに従っている場合は、次のように推奨PCR条件を設定します。
   1. 95°Cで10分間の初期変性。
   2. 94°Cで30秒間変性させるには40サイクル、アニールするには55°Cで1分間、延長するには60°Cで2分間を設定します。
   3. 98°Cで10分間保持します。
   4. 4°C.
      で保持します 手記： 特定のプライマーとプローブセットのアニーリング温度は、温度勾配を使用して最適化できます。すべてのステップで2°C/sのランプレートを使用します。PCR条件は、各実験デザインとセットアップに応じて調整する必要があります。

5. 液滴の読み取り

1. プレートをドロップレットリーダーにしっかりと置き、ウェルA-1を左上にします(角が滑らかになり、他の3つはエッジになります)(図1D)。
2. プログラムでプレートをセットアップします:FAMを既知の基準チャネルとして指定し、HEXを未知のチャネルとして指定します(図2A)。
3. Droplet reading Experimentを直接定量化として実行します。実行が終了したら、解析の実験タイプをドロップオフ(DOF)に変更します(図2A)。

結果

図1:実験のセットアップと手順。 (A)液滴生成のためのカートリッジの準備。(トップ)サンプルはカートリッジの中央の列に充填され、オイルは下部の行に充填されます。(ボトム)液滴生成後の乳化液滴で満たされた上の行。(B)サンプルが充填され、ガスケットで覆われたカートリッジを備えた液滴発生器。(C)サーモサイクラーでホイルシールで覆われた96ウェルプレート。(D)96ウェルプレートを所定の位置に取り付け、プレートに金属カバーを掛けて固定したドロップレットリーダー。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
ddPCR Super Mix for Probes (dUTPなし)	バイオ・ラッド	1863024
EDTA(pH 8.0)	インビトゲン	AM9260G
PCRグレードの水			認定されたPCRグレードの水であれば、どれでも使用できます
プロテイナーゼK 20 mg/mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM2546
料
ddPCR 96ウェルプレート	バイオ・ラッド	12001925
液滴発生器 DG8 カートリッジとガスケット	バイオ・ラッド	1864007
プローブ用液滴発生油	バイオ・ラッド	1863005
蛍光プローブ(FAM/HEXプローブなど)	シグマ・アルドリッチ	該当なし	プローブは実験専用で、認定販売者から購入できます。
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマー	シグマ・アルドリッチ	該当なし	プライマーは実験専用で、認定販売者から購入できます。
備品
C1000タッチサーマルサイクラー	バイオ・ラッド	1851148	グラジエント機能付き他のサーモサイクラーやディープウェルも使用可能

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