最適なアニーリング温度を決定するためのグラジエントポリメラーゼ連鎖反応

要約

出典:Tsujimoto, H. et al., Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、プライマーのアニーリング温度を最適化するためのグラジエントポリメラーゼ連鎖反応を示しています。これにより、ウェルに沿ってグラジエントアニーリング温度が設定されます。異なるアニーリング温度の影響は、反応条件の最適化に役立つ増幅生成物の収率によって決まります。

プロトコル

1. 一塩基多型(SNP)のスキャン、HRMAプライマー設計、プライマーバリデーション

1. 野生型実験室コロニー蚊におけるSNP同定
   1. 適切なポリペプチド翻訳を破壊する標的エクソンを選択します。
      手記：ターゲットは、開始コドンに近いか、タンパク質機能に必要な主要な残基の中にある必要があります。エクソンが短いほど(例:≤200塩基)、標的化と解析が難しくなります。エクソンの境界付近での編集は、HRMAプライマーの1つがイントロンを通過するか、イントロンに入ることを余儀なくされるため、避けてください。これらの地域ではSNP率がはるかに高くなる傾向があるため、これは望ましくありません。
   2. プライマーデザイン
      1. NCBI Blast - Primer Blastのウェブサイトにアクセスし、選択したエクソンをコピーしてページ上部のボックスに貼り付けます | PCR産物のサイズを選択します(エクソンの大部分を網羅していることを確認してください) | 生物を選択します。
      2. [詳細パラメータ] |Opt(PCR Product Tm用)および60を添加(最適温度60°C用)|プライマーを入....

結果

図1:SNPの識別。 野生型由来のAaeZIP11フラグメントのマルチプルシーケンスアラインメントの模式図。赤はSNP、緑はSNPのないフラグメントです。このSNPフリー領域は、sgRNAおよびプライマーの設計に推奨されます。略語:SNP =一塩基多型;sgRNA = シングルガイドRNA;LVP = リバプールのひずみ。

....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70%エタノール			水に70%エタノール溶液
96ウェルPCRおよびリアルタイムPCRプレート	VWRの	82006-636	ゲノムDNAの取得用(蚊の足から)
96ウェルプレートテンプレート			自家製プリント、遺伝子型記録用
バイオ・ラッド CFX96	バイオ・ラッド		グラジエント機能とHRMA機能を備えたPCRマシン
多様化したバイオテクノロジー試薬リザーバー	VWRの	490006から896
Exo-CIP 迅速 PCR クリーンアップキット	ニューイングランドバイオラボ	E1050Sの
ガラスペトリ皿	VWRの	89001-246	150 mm x 20 mm
Nuncポリオレフィンアクリレートシーリングテープ、Thermo Scientific	VWRの	37000-548	ゲノムDNAを取得するための96ウェルPCRプレートと併用します
Phire Animal tissue direct PCR Kit(サンプリングツールなし)	サーモフィッシャー	F140WHの	ゲノムDNAの取得とPCRの実施に
精密溶融分析ソフトウェア	バイオ・ラッド	1845025	蚊のDNAサンプルのジェノタイピングおよび二本鎖DNAの熱変性特性の分析に使用されます(プロトコルステップ3.3を参照)
シングルチャンネルピペッター	ギルソン
Phire Animal tissue direct PCR Kit(サンプリングツールなし)	サーモフィッシャー	F140WHの	ゲノムDNAの取得とPCRの実施に
SeqMan Pro(シークマンプロ)	DNAstar Lasergeneソフトウェア		マルチシーケンスアラインメント用
シングルチャンネルピペッター	ギルソン