最適なアニーリング温度を決定するためのグラジエントポリメラーゼ連鎖反応

要約

出典:Tsujimoto, H. et al., Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、プライマーのアニーリング温度を最適化するためのグラジエントポリメラーゼ連鎖反応を示しています。これにより、ウェルに沿ってグラジエントアニーリング温度が設定されます。異なるアニーリング温度の影響は、反応条件の最適化に役立つ増幅生成物の収率によって決まります。

プロトコル

1. 一塩基多型(SNP)のスキャン、HRMAプライマー設計、プライマーバリデーション

1. 野生型実験室コロニー蚊におけるSNP同定
   1. 適切なポリペプチド翻訳を破壊する標的エクソンを選択します。
      手記：ターゲットは、開始コドンに近いか、タンパク質機能に必要な主要な残基の中にある必要があります。エクソンが短いほど(例:≤200塩基)、標的化と解析が難しくなります。エクソンの境界付近での編集は、HRMAプライマーの1つがイントロンを通過するか、イントロンに入ることを余儀なくされるため、避けてください。これらの地域ではSNP率がはるかに高くなる傾向があるため、これは望ましくありません。
   2. プライマーデザイン
      1. NCBI Blast - Primer Blastのウェブサイトにアクセスし、選択したエクソンをコピーしてページ上部のボックスに貼り付けます | PCR産物のサイズを選択します(エクソンの大部分を網羅していることを確認してください) | 生物を選択します。
      2. [詳細パラメータ] |Opt(PCR Product Tm用)および60を添加(最適温度60°C用)|プライマーを入手してください。他のパラメータはデフォルトのままにします。
   3. 野生型実験室コロニーからゲノムDNA(gDNA)を取得します。10匹の蚊を脇に置き、CO₂で麻酔をかけ、氷の上のペトリ皿に置いて不活性に保ちます。組織からのDNA放出用の試薬0.5 μLと希釈バッファー20 μLを含む10本のチューブをセットアップします。これらはどちらも、材料表に示されているDNAリリースキットに含まれています。
   4. 鉗子を使用して1匹の蚊から片方の脚を取り出し、DNA放出試薬の希釈溶液(ステップ1.1.3から)の対応するチューブに入れ、脚を溶液に完全に浸します。残りの蚊でこの手順を繰り返し、鉗子を70%エタノールで拭いてから次の蚊に進みます。
   5. レッグ含有溶液を室温で2〜5分間インキュベートし、次に98°Cで2分間インキュベートし、PCR反応を設定しながら冷却します
      手記：放出されたgDNAを含むプレートは-20°Cで保存でき、この時点でプロトコールを一時停止できます。
   6. 10 μL の 2x PCR Master Mix、最終濃度 0.5 μM のプライマー、最終容量 20 μL の分子グレードの水を含む 10 本のチューブを調製し、希釈したサンプルの 1 μL を各チューブに移します。98 °C 5 min、98 °C を 40 サイクル、5 秒、60 °C 30 秒、72 °C 20 秒/kb のサイクルで PCR を実行します。72°Cの最終延長を1分間行います。
   7. 酵素でPCR産物を精製して、残留PCRプライマーを分解し、過剰なdNTPまたは任意のカラムクリーンアップキットを脱リン酸化します。サンプルのシーケンシングに進みます。
   8. 各エレクトロフェログラムを分析して、ダブルピーク/あいまいな塩基の存在を確認し、適切な縮退ベースコードを使用して各シーケンスのベースコールを手動で調整します。
      手記：このステップは、ベースコールソフトウェアがより顕著なピークを「真の」ベースコールとして選択し、SNPが存在しないという誤った印象を与えることが一般的であるため、マルチプルシーケンスアラインメントの前に実行する必要があります。
   9. Table of Materials に記載されているアライメントソフトウェアである SeqMan Pro または、ClustalW や T-Coffe などの他のオープンソースのアライメントソフトウェアを使用して、マルチシーケンスアライメントを実行します。
      1. アライメントソフトウェアを開く | Add Sequencesをクリック | 目的のシーケンスを選択し、Add |すべてのシーケンスを選択したら、[完了]をクリックします。
      2. [アセンブリ]をクリックして、位置合わせを実行します。アライメントを開くには、Contig 1 をクリックしてアライメントを解析し、SNP を特定します (図 1).
         手記：ステップ1.1.3〜1.1.6の代替として、バルクサンプル(>10個体に由来する)から得られた単離されたゲノムDNAからPCRを実施することができる。シーケンシングされたアンプリコンは、エレクトロフェログラムでダブルピークとして現れるSNPの存在を直接分析できますが、まれなSNPの検出はより困難になります。
   10. 3-5シングルガイドRNA(sgRNA)を設計し、上記で同定した任意のSNPを含む領域を避け、に記載されているプロトコルに従います。

2. HRMAプライマー設計

1. mFoldを使用して、PCR中に二次構造が形成される可能性についてエクソン配列を試験します。
   1. UNAFold Webサーバーに移動し、mFold | | ドロップダウンメニューでApplications |DNAフォールディングフォーム。
   2. ボックスに配列名を入力し、エクソンを貼り付けます。
   3. フォールディング温度を60°Cに変更し、Ionic条件で[Mg⁺⁺]を1.5に変更し、[Units]をmMに変更して[Fold DNA]をクリックします。
   4. OutputのStructure 1の下のpdfをクリックして、Circular Structure Plotsを開きます。
2. NCBI Blast - Primer Blastでプライマーデザインをご覧ください。
3. ステップ1.1のシーケンシングで決定した選択したエクソン配列(SNPの数が最も少ない、またはSNPを含まない配列)をコピーして、ページ上部のボックスに貼り付けます。
4. シンボル< >を使用して、SNP、ターゲット部位、および二次構造の形成が可能な領域を含む配列をマークし、除外します。
5. PCR産物のサイズを80〜150 bpに選択し、生物を選択します.
   手記：より大きなフラグメントサイズ(~300 bp)をうまく使用できます。しかし、アンプリコンが長いと、1つまたは数つの塩基対で異なる配列間の感度が低下する可能性があります。
6. 「入門書を入手」をクリックします。試験するプライマーを2〜3ペア選択します(理想的には、プライマー部位はCRISPRターゲット部位から≥20〜50 bp離れています)。

3. プライマー検証

1. 1人の個人からのgDNAを使用してグラジエントPCRを実行します。
   1. マスターミックスを調製し、別のチューブでノンテンプレートコントロール(NTC)用のサンプルを1つ取り出します。テンプレートを残りのマスターミックスに加え、96ウェルプレートに分注します。
   2. サイクリングパラメータに従います:98 °C 30 s、98 °Cを34サイクルで10 s、55–65 °C 30 s、72 °C 15 s、最終延長72 °Cで10分間
   。
   3. パラメータに従って熱融解プロファイルを生成します:変性ステップ95°Cで1分間、60°Cで1分間アニーリング、75°Cから95°Cまでの0.2°C刻みの融解曲線検出、各温度で10秒の保持時間
      手記：単一の熱溶融プロファイルを持つアニーリング温度のみを使用する必要があります。

結果

図1:SNPの識別。 野生型由来のAaeZIP11フラグメントのマルチプルシーケンスアラインメントの模式図。赤はSNP、緑はSNPのないフラグメントです。このSNPフリー領域は、sgRNAおよびプライマーの設計に推奨されます。略語:SNP =一塩基多型;sgRNA = シングルガイドRNA;LVP = リバプールのひずみ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70%エタノール			水に70%エタノール溶液
96ウェルPCRおよびリアルタイムPCRプレート	VWRの	82006-636	ゲノムDNAの取得用(蚊の足から)
96ウェルプレートテンプレート			自家製プリント、遺伝子型記録用
バイオ・ラッド CFX96	バイオ・ラッド		グラジエント機能とHRMA機能を備えたPCRマシン
多様化したバイオテクノロジー試薬リザーバー	VWRの	490006から896
Exo-CIP 迅速 PCR クリーンアップキット	ニューイングランドバイオラボ	E1050Sの
ガラスペトリ皿	VWRの	89001-246	150 mm x 20 mm
Nuncポリオレフィンアクリレートシーリングテープ、Thermo Scientific	VWRの	37000-548	ゲノムDNAを取得するための96ウェルPCRプレートと併用します
Phire Animal tissue direct PCR Kit(サンプリングツールなし)	サーモフィッシャー	F140WHの	ゲノムDNAの取得とPCRの実施に
精密溶融分析ソフトウェア	バイオ・ラッド	1845025	蚊のDNAサンプルのジェノタイピングおよび二本鎖DNAの熱変性特性の分析に使用されます(プロトコルステップ3.3を参照)
シングルチャンネルピペッター	ギルソン
Phire Animal tissue direct PCR Kit(サンプリングツールなし)	サーモフィッシャー	F140WHの	ゲノムDNAの取得とPCRの実施に
SeqMan Pro(シークマンプロ)	DNAstar Lasergeneソフトウェア		マルチシーケンスアラインメント用
シングルチャンネルピペッター	ギルソン